16.黄芪 当归 : 【中医理论】
黄芪一两,当归(酒洗)二钱,水煎服。该药对配伍为方,又称当归补血汤,见《内外伤辨惑论》^[1],是甘温除热的代表方。用于治疗劳倦内伤,气弱血虚,阳浮外越,肌肤燥热,面红目赤,烦渴引饮,脉洪大而虚,以及妇人经行、产后血虚发热头痛,或疮疡溃后久不愈合者。方中重用黄芪大补脾肺之气,以资气血生化之源,为君药,配伍当归甘辛而温,养血和营,为臣药。两药配用,使阳生阴长,气旺血生,气血双补,正如《医方考》谓:“血实则身凉,血虚则身热。或以饥困劳役虚其阴血,则阳独治,故令肌热、目赤、面红、烦渴引饮。此证纯象伤寒家白虎汤之证,但脉大而虚,非大而长,为可辨耳。《内经》所谓脉虚血虚是也。当归味厚,为阴中之阴,故能养血,而黄芪味甘补气者也。今黄芪多于当归数倍,而日补血汤者,有形之血不能生,生于无形之气故也。”
本方尚有异名多个:黄芪当归汤(《兰室秘藏》卷上)、芪归汤(《周慎斋遗书》卷五)、归芪汤(《医学入门》卷七)、补血汤(《脉因证治》卷上)、黄芪补血汤(《产科心法》下集)。
《圣济总录》卷一二八也用黄芪(锉)十两、当归(切,焙)八两,为散,三钱匕,以温酒调下,用治石痈久不愈,方名黄芪当归散。石痈者,其痈坚硬如石也,乃气血凝结瘀滞所致。本方黄芪气雄力专,能补气以行血,所谓“气行则血行”;当归味厚气薄,能活血以散瘀。二药又可补气养血,扶正以托毒,故治之。
【药理研究】
1.工艺制备
1.1 当归补血丸
当归160g,黄芪400g以上二味,粉碎成细粉,过筛,混匀。每100g粉末加蜜100～300g,制成大蜜丸,或加炼蜜30g～40g与适量水混匀,泛丸,干燥,即得^[2]。
1.2归芪冲剂^[2]
当归150g,黄芪100g,大枣100g,取当归加等量乙醇,回流1.5h,滤过备用;当归渣与黄芪、大枣加水煎煮二次,每次2h,合并煎液,浓缩至适量,加2倍量乙醇搅拌,放置,滤过,滤液回收乙醇,浓缩成稠膏,加入蔗糖粉混匀制粒,低温干燥,过筛,喷加上述当归乙醇液,混匀,分装,即得。
1.3 当归注射液
当归250g,取当归切成薄片,经水蒸气馏得馏液400ml,另置,药液滤过,药渣加水煎煮二次,每次30min,合并煎液,滤过,滤液浓缩至每1ml相当于原生药2～2.5g。加乙醇使溶液的含醇量为75%,冷藏24h,滤过,滤液回收乙醇至无醇味,加水250ml,煮沸后冷藏12h,滤过,与上述馏液合并,加入吐温-80及氯化钠,滤过,滤液加注射用水使成1000ml,用20%氢氧化钠溶液调节pH值至7,滤过,灌封,灭菌,即得^[2]。
2.薄层鉴别
2.1 当归补血丸剂中当归的薄层色谱鉴别方法。
取本品9g,剪碎,加石油醚(30～60℃)40ml,加热回流10min,滤过,滤液室温挥发至1ml,作为供试品溶液。另取当归对照药材5g,同法制成对照药材溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯-石油醚(30～60℃)(1:4)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,再喷以1%香草醛盐酸试液,在105℃烘约10min,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。^[2]。
2.2 归芪冲剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法
取本品10g,加无水乙醇50ml,置水浴上保持微沸20min,滤过,滤液浓缩至5ml,作为供试品溶液。另取黄芪对照组药材5g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以0.2%茚三酮乙醇溶液,置110℃加热数分钟。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点^[2]。
2.3 归芪冲剂中大枣的薄层色谱鉴别方法
方法1:取本品10g,加无水乙醇约50ml,置水浴上保持微沸20min,滤过,取液浓缩,作为供试品溶液,另取大枣对照药材5g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚-乙醚-冰醋酸(10:10:0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%磷钼酸乙醇溶液,置120℃加热数分钟。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点^[2]。
方法2:同上法制成供试品、对照药材溶液,点样后以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以0.2%茚三酮乙醇溶液,置110℃加热数分钟。供试品色谱中,与在对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点^[2]。
2.4 注射剂中阿魏酸的薄层色谱鉴别方法
方法1:取本品20ml,用乙醚提取二次(30、20ml),合并乙醚液,自然挥干,残渣加无水乙醇2ml使溶解,作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液20μl,对照品溶液10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-醋酸乙酯(8.5:1.5)或石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(8.5:1.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365mn)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同亮蓝绿色荧光斑点^[2]。
方法2:取本品25ml,置分液漏斗中,用0.5mol/L硫酸酸化至pH1～2,再以醋酸乙酯提取4次(25、20、20、10ml),合并提取液,置水浴上浓缩至5ml,作为供试品溶液。另取阿魏酸对照,加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯-甲酸(5:3:0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点。
3.含量测定
3.1 当归补血胶囊剂中黄芪甲苷薄层扫描法定量分析^[3]
层析条件:吸附剂:含0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(厚度0.5 mm);展开剂:氯仿-甲醇-水(65:35:10,5～10℃放置12b)的下层溶液;显色剂:10%硫酸乙醇液(105℃烘约5min)。扫描条件:双波长反射法锯齿扫描,λs=410nm,λR=700nm,狭缝:1.2×1.2mm Sx=3。
线性关系:精密称取黄芪甲苷对照品,用无水甲醇溶解并制成1mg/ml的溶液,用定量毛细管吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,分别点于同一薄层板上。展开显色后扫描,测定面积积分值,用最小二乘法求得回归方程:Y=5936.6X+2530.5,r=0.9999。线性范围为1.06～5.30μg。
精密度试验:在同一块薄层板上,共点6个点,展开,显色扫描,测定面积积分值。结果,均值为22482.00,RSD为1.06%。
稳定性实验:取供试品溶液点于薄层板上,展开,显色,每隔0.5h连续扫描2次,2.0h内测定10次,峰面积基本不变,RSD为1.30%,证明黄芪甲苷薄层显色后,2.0h内测定结果是稳定的。
回收率测定:精密称取已知含量的样品粉末2g,准确加入黄芪甲苷对照品约1ml(相当于黄芪甲苷对照品溶液1mg),依法测定,结果见表12-16-1。

表12-16-1 当归补血胶囊黄芪甲苷薄层扫描法加样回收率测定

样品号 黄芪甲苷(μg) 测出量
(μg) 回收率
(%) 平均回收率
(%) RSD
(%) 样品中含量 加入量 1
2
3
4
5 1.037
1.036
1.010
1.003
1.018 1.042
1.035
1.086
1.022
1.103 2.033
2.049
2.051
1.974
2.065 95.59
97.87
95.86
95.01
94.92 95.85 1.25

样品测定:取本品内容物2g,精密称定,加30ml甲醇浸泡过夜,再加甲醇置索氏提取器中提取4h。提取液水浴浓缩至干,残渣加20ml饱和食盐水,分次溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇提取4次(20ml×2;10ml×2),合并正丁醇提取液,加2g氧化镁,搅拌,水浴蒸干,加少量甲醇将粉末湿润后装入滤纸筒,置索氏提取器中,加甲醇回流提取4h。回收溶剂至干,残渣加无水甲醇使溶解,定量转移至5ml量瓶内,并稀释至刻度作为供试品溶液。
另精密称取黄芪甲苷标准品,用甲醇配制成1mg/ml的溶液,作为对照品溶液。精密吸取以上供试品溶液、对照品溶液,分别点于同一薄层板上,展开,显色后,在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板,周围用胶布固定后扫描,测量供试品吸收度、积分值与对照品吸收度积分值,测定结果见表12-16-2。

表12-16-2 样品测定结果

样品号 含量(mg/g) 平均含量(mg/g) RSD(%) 1
2
3
4
5 0.411
0.421
0.417
0.405
0.414 0.414 1.426

3.2当归补血口服液中阿魏酸薄层扫描定量分析
样品的制备:取本品20 ml,碱化至pH10左右,分别用石油醚10 ml、9 ml萃取脱脂,弃去石油醚层。然后用盐酸酸化至pH2.0左右,用醋酸乙酯30 ml分次萃取(10ml、8ml、6ml、6ml),合并醋酸乙酯萃取液,过滤,回收醋酸乙酯,用醋酸乙酯溶解残渣并定容5ml即得供试品溶液。
阿魏酸对照液的制备:精密称取干燥至恒重的阿魏对照品0.0135g,用95%乙醇溶解,稀释至50ml,即得0.27mg/ml的对照品溶液。
样品含量测定:用定量毛细管吸取供试品溶液10.0μl,对照品溶液3.0μl点于同一块硅胶G-CMC板(厚0.5mm)上,以展开剂石油醚:氯仿:冰醋酸:甲醇(5:3:1:0.5)上行展开,展开至前沿12cm处取出晾干,紫外光灯波长254 nm下展示定位,将层析的斑点于薄层扫描仪上,以λS=322 nm、λR=365 nm,SX=3的条件下,校正背景,反射法锯齿扫描。结果按外标一点法计算阿魏酸含量(回收方程Y=65997.8X-1138.6,r=0.998,Y为扫描斑点的积分面积,X为点样量。,阿魏酸范围0.27～1.35μg线性良好)。本方法结果在4h内稳定。展开后斑点积分面积的CV=0.2%。所加样品中阿魏酸的平均回收率为97.9%,CV=1.0%^[4]
3.3 当归补血口服液中阿魏酸薄层分析-洗脱-紫外分光光度法定量分析^[5]
标准品溶液:取阿魏酸对照品10mg,精密称定,置10ml容量瓶中,加醋酸乙酯至刻度,摇匀,即得,浓度为0.967g/L。供试品溶液:精密取当归补血口服液100ml,以20% NaOH调pH12～14,以醋酸乙酯洗涤2次,每次40 ml,弃去醋酸乙酯液,碱液以盐酸调pH1～2,以乙醚萃取5次(50,40,30,30,30 ml),合并乙醚液,回收乙醚至干,残渣以醋酸乙酯溶解并定容至5 ml容量中,备用。阴性对照液:按处方除去当归,依法制成阴性对照液。
绘制吸收光谱:吸取标准品溶液、供试品溶液及阴性对照液各80μl,点于含0.5%CMC-Na为粘合剂的硅胶G薄层板上使成条状,以石油醚(60～90℃)-氯仿-冰醋酸(12:4:1)为展开剂(10℃以下展开),取出,晾干,置紫外灯(254nm)下检视,将标准品及与标准品相应位置上的供试品及阴性对照液条斑刮入5ml离心管中,同时刮取同一薄层板上与标准品相应位置上的等面积的空白硅胶G,置另一5 ml离心管中,作为空白对照,分别精密加入10%乙醇5 ml,充分振摇3 min,离心,取各上清液,按分光光度法在200～400 nm波长间扫描,绘制吸收光谱。由光谱图可知,供试液与标准品紫外光谱一致,最大吸收波长为318 nm,阴性液则无吸收。
标准曲线的绘制:精密吸取标准溶液20,25,30,35,40μl于试管中,水浴挥干,各精密加入10%乙醇5 ml,充分振摇,取上述溶液,以10%乙醇为空白对照,按分光光度法在318 nm波长处测定吸收度,测定结果如表12-16-3。
以吸收度(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,回归方程为A =0.0272 +0. 05843 C,r =0.9999,表明在上述浓度范围内,线性关系良好。

表12-16-3 当归补血口服液中阿魏酸薄层层析-紫外分光光度法标准曲线测定结果

浓度(mg/L)
吸收度 2.868
0.253 4.835
0.309 5.802
0.367 6.769
0.424 7.736
0.478

稳定性试验:精密吸取供试品溶液(制法同前)100μl,按上述方法点样,展开,洗脱,在318 nm的波长处测定吸收度,从洗脱至洗脱后3 h内测定值如表12-16-4。结果显示待测液稳定性良好。

表12-16-4 当归补血口服液中阿魏酸薄层层析-紫外分光光度法稳定性考察

洗脱时间(min)
吸收度 0
0.316 15
0.316 30
0.317 60
0.316 90
0.316 120
0.317 180
0.316

精密度试验:精密吸取供试品溶液100μl,依法实验,测定结果见表12-16-5。

表12-16-5 当归补血口服液中阿魏酸薄层层析-紫外分光光度法精密度考察结果

样品号
吸收度 1
0.317 2
0.316 3
0.316 4
0.315 5
0.316 RSD
0.23%

回收率测定:精密吸取阿魏酸标准品溶液1ml(相当于阿魏酸967μg)于烧杯中,挥干,再精密吸取当归补血口服液100ml(含阿魏酸1 125μg)于同一烧怀中,按前述方法进行回收率测定,结果见表12-16-6。回收率测定结果表明,本测定方法可靠,重现性好。

表12-16-6 当归补血口服液中阿魏酸薄层层析-紫外分光光度法回收率测定

样品 点样量(μl) 吸收度 加入阿魏酸(μg) 测出阿魏酸(μg) 回收率 1
2
3
4
5 80
80
80
80
80 0.418
0.414
0.420
0.416
0.413 967
967
967
967
967 965.11
943.71
975.80
954.41
938.37 99.80
97.59
100.91
98.70
97.04

样品测定:精密吸取当归补血口服液100ml,制备供试品溶液,依法点样,展开,洗脱,测定,依回归方程计算百分含量,测定结果见表12-16-7。

表12-16-7 样品中阿魏酸含量测定结果

样品 点样量(μl) 吸收度 阿魏酸含量(mg/ml) 平均含量(mg/ml) 1
2
3
4
5 110
110
100
120
100 0.319
0.316
0.316
0.313
0.316 0.318
0.317
0.317
0.311
0.317 1.135
1.123
1.236
1.019
1.236 1.131
1.127
1.240
1.012
1.240 1.133
1.125
1.238
1.016
1.238

3.4归芪口服液中阿魏酸的反相高效液相色谱法定量分析
色谱条件:色谱柱:KYNO-ODS-C1810μm,Ф0.46cm×22cm不锈钢柱;流动相:甲醇-乙腈-1%冰醋酸(25:25:50);流速:1.0ml/min;检测波长:323nm;纸速:1.0ml/min;进样量:10μl。定量方法:外标峰面积标准曲线法。检测波的确定:用1%冰醋酸甲醇溶液配制阿魏酸对照品溶液0.094mg/ml,于波长260～400nm扫描,在323nm波长处有最大吸收,故选定323nm作为检测波长。流动相的选择;阿魏酸具弱酸性,通过调整流动相冰醋酸与甲醇的比例,使其在柱中保留时间合适,分离发生明显改变,故选定甲醇-乙腈-1%冰醋酸(25:25:50)为流动相,分离效果最佳,操作时间约6min。
标准曲线制备:精密称取阿魏酸对照品,用1%冰醋酸甲醇溶液配制成每1ml含94%μg的阿魏酸对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml,分别置10ml容量瓶中,定量。进样,记录峰积分面积。阿魏酸在3.76～11.28μg范围内色谱峰积分面积与浓度呈良好的线性,回归方程为:Y=-2390+65623X,r=0.9999。
样品测定:精密量取样品液10ml,置分液漏斗中,用乙醚提取3次,每次20ml,合并乙醚液,回收乙醚近干,挥干残余乙醚,用1%冰醋酸甲醇液稀释残渣至10ml容量中,定容,作为供试品溶液。取供试液,进样10μl,测定,根据标准曲线读出供试品中阿魏酸的含量,测定3批样品,每批样品的3次平均含量分别为7.302、6.626和7.345μg/ml。
回收率实验:分别在3批阴性样品(缺当归)中精密加入阿魏酸对照品,按上述提取方法操作测定,计算平均回收率为98.90%,RSD为1.6%^[6]。
王宏洁等选用4种不同提取、分离方法对当归补血汤中阿魏酸的含量进行HPLC法测定比较,结果表明:水煎法中阿魏酸的含量明显低于甲醇回流的方法,且回收率较低^[7]。
4.单煎混煎提取对化学成分的影响^[8]
药物的提取与配制:单煎:按实验处方剂量取药材分别单独加水煎煮2次(第1次加水8倍量,煎煮1.5h,第2次加水6倍量,煎煮1h),将2次煎出液合并,浓缩成单味药浸膏,然后根据处方组成合并得当归补血汤和四物汤单煎提取物。单煎醇沉:按实验处方剂量取药材分别单独加水煎煮二次,煎煮方法同上,煎出液浓缩至浸膏,加2倍量95%醇搅拌静置过夜,滤取乙醇液并浓缩成单味药浸膏,然后根据处方组成合并得当归补血汤和四物汤单煎醇沉提取物。共煎:按实验处方剂量取药材合并加水煎煮2次,煎煮方法同上。煎出液浓缩成浸膏,得当归补血汤共煎提取物和四物汤共煎提取物。单味颗粒剂混合:单味颗粒剂按所含的生药量折算,根据实验处方剂量取相应的量合并混合,配制成当归补血汤单味颗粒剂混合物和四物汤单颗粒剂混合物。
薄层定性分析:供试液制备:取生药量相当的当归补血汤和四物汤的单煎提取物,单煎醇沉提取物、共煎提取物、单味颗粒剂混合物,分别加一定量的氯仿,超声波振荡处理30min,分离氯仿提取液,水浴蒸发至干,残渣加少量氯仿溶解,得氯仿供试液,供薄层层析用。取生药量相同的当归补血汤和四物汤的单煎提取物、单煎醇沉提取物、共煎提取物、单味颗粒剂混合物,分别加一定量的甲醇,超声波振荡处理30min,分离甲醇提取液,水浴蒸发至干,残渣加少量甲醇溶解,得甲醇供试液,供薄层层析用。
薄层层析:取上述氯仿供试液,分别点样于同一块硅胶G薄板上,以氯仿一丙酮(40:60)为展开剂,上行展开15cm,取出薄板晾干,于紫外灯365nm下检视。取上述甲醇供试液,分别点样于同一块硅胶G薄板上,以苯一醋酸乙酯(30:70)为展开剂,上行展开15cm,取出薄板晾干,于365nm紫外光灯下检视。薄层层析结果表明,当归补血汤提取物样品的氯仿供试液和甲醇供试液所显示的特征斑点基本相同;四物汤提取物样品的甲醇供试液所显示的特征斑点亦基本相同,而氯仿供试液的共煎样品比其他样品多1～2个斑点。
提取物中指标成分阿魏酸的含量比较:供试品溶液的制备:根据处方组成,取含生药量相同的当归补血汤和四物汤的单煎提取物、单煎醇沉提取物、共煎提取物及单味颗粒剂混合物,分别置三角烧杯中,加适量甲醇,超声波振荡处理30min,离心沉淀,取上清液置25ml量瓶,甲醇加至刻度,经0.45μm滤膜过滤,得供试品溶液。对照品溶液的制备:精密称取阿魏酸对照品1mg,置于10ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制阿魏酸浓度为0.1mg/ml的对照品溶液。
色谱分析条件:流动相:甲醇-5%醋酸(35:65);检测波长320nm;流速0.7ml/min;灵敏度O.1AUFS;纸速0.3cm/min。分析色谱图表各组分分离效率最佳。标准曲线的绘制:取阿魏酸对照品溶液,分别以2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μl进样,按上述色谱分析条件,测得色谱峰面积,以阿魏酸的进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,在0.2μg-1.0μg间峰面积y与进样量x呈线性关系,回归方程为:Y=25383.05X-2694.6,r=0.9998(n=5)。
供试品测定:取对照品溶液、供试品溶液适量,按上述色谱分析条件测定,以外标法计算供试品中阿魏酸含量,测定结果见表12-16-8。
测定结果表明,实验处方中指标成分阿魏酸的提取量,共煎>单煎>单煎醇沉>单味颗粒剂混合,共煎比单煎高,而共煎与单煎醇沉、单味颗粒剂混合则有非常明显差异。

表12-16-8 供试品中阿魏酸定量测定结果

实验处方提
取与配制 当归补血汤 四物汤 提取物中阿魏酸量(mg) 提取物中阿魏酸量(mg) 单煎
单煎醇沉
共煎
单味颗粒剂混合 1.2784
0.9869
1.4138
0.6534 5.6156
3.8095
7.1733
1.6508

另有当归补血胶囊制剂工艺及配伍比较,分析等研究报道^[9～11]。
【药理研究】
1.补血作用
1.1对红系造血细胞克隆的影响^[12]
当归补血汤按归芪1:5和1:1两种配伍分别水煎两次,煎液过滤,混合浓缩;单味黄芪和单味当归同法制备成水煎液,各药液浓度均为1.32g饮片/ml。
含药血清的制备:小鼠口饲当归补血汤等各受试药0.1ml/10g体重,药后1h小鼠吸入乙醚麻醉,无菌条件下腹主动脉取血,离心取血清,做为各受试药含药血清。
空白血清的制备:口饲小鼠与给药组等体积的水,同上法制备血清,做为空白对照血清。
小鼠造血祖细胞(红系)的获取:无菌条件下取小鼠股骨,用IMDM培养液冲出骨髓,用白细胞记数法记数有核细胞,调整细胞悬液中有核细胞量,使每个培养孔中的有核细胞为0.5×105个/ml。
红系祖细胞体外培养体系:一个培养体系的总体积为2～2.5ml,其中包括10-4mol/L二巯基乙醇0.2ml、3%L-谷氨酰胺0.03ml、马血清0.5ml、EPO(10U/ml)0.2ml、BPA0.2ml、IL-20.1ml、2.7%甲基纤维素0.7ml,有核细胞悬液0.2ml,受试药(或含药血清)不超过0.4ml用IMDM将体积补齐。
红系祖细胞的体外培养:将上述体系加入直径为1.5cm的验血皿中,每皿加0.2ml,每1体系数8个皿,其中4皿培养3d,计数红细胞系集落生成单位(CFU-E),另4皿培养7d计数红细胞系爆增型集落生成单位(BFU-E),均放人培养箱中37.5℃,5%CO2,饱和湿度下培养。
红系集落的染色与观察:取出培养的样品,每皿滴加生理盐水2～3滴,15min后滴加染色工作液3滴,10min后观察。染色工作液为1%二甲氧基联胺5ml+H2O2工作液0.2ml,H2O2工作液为蒸馏水0.9ml+7.5%H2O20.1ml。在10×10倍光镜下计数红色集落,CFU-E集落大于8个细胞,BFU-E集落大于50个细胞。每一样品取4个皿计数的平均数值,每1试验均重复3次。
1.1.1当归补血汤含药血清对小鼠红系细胞(CFU-E)克隆生长的影响:该项实验中不加外源性刺激因子,每一培养体系中加入马血清0.7ml,当归补血汤、含药血清和正常血清剂量分别为50、100、150、200μl,总体积2.75ml,每一培养孔内加入有核细胞1×105个,培养3d,计CFU-E数值,重复两次,实验结果一致,取其均值。结果空白对照组50μl为100、100μl为140,150μl为128,200μl为90;13.2g/kg血清组对应值分别为170、220、216、150;19.8g/kg血清组对应值分别为260、318、322、272,原药液组均为0。结果表明,当归补血汤的各剂量组对早期(3d)红系造血细胞均无刺激生长的作用,正常小鼠血清内含有内源性促红系祖细胞生长的刺激因子,随受试血清剂量增加刺激CFU-E活性物质的含量也增加,但当血清量增加为0.2ml时其总血清含量超过体系的30%(培养体系中还有马血清),对CFU-E反而产生抑制作用。口饲小鼠当归补血汤后的含药血清对CFU-E有更强的刺激生长作用,与正常对照血清相比有明显差异,其差值为当归补血汤经小鼠吸收、代谢后在血清中产生的活性物质的药效强度。
1.1.2 不同配伍的当归补血汤及其组成药味的含药血清对红系造血祖细胞克隆的影响
加入外源性刺激因子对CFU-E和BFU-E的影响结果阴性对照(无受试血清)组CFU-E(6)为112.7±6.4,BFU-E(6)为11.3±1.5;正常血清组分别为131.7±10.5,16.3±1.2;当归血清组分别为168.0±2 4.3,121.3±1.5;黄芪血清组分别为214.3±14.5,29.0±5.0;归芪1:5血清组分别为206.3±16.3,28.3±3.5;归芪1:1血清组分别为192.3±16.6,22.3±3.2。
在培养体系中加入外源生长刺激因子EPO、BPA、IL-Ⅲ才能救活阴性对照组(不加任何药物或受试血清)培养体系中红系祖细胞集落的生长,阳性对照组(加入正常小鼠血清0.2ml)CFU-E和BFU-E的增殖均比阴性对照组增加,可见小鼠正常血清内含有刺激红系祖细胞增殖的内源性刺激因子。各含药血清组与正常血清组比较均有明显的刺激CFU-E和BFU-E增殖的作用。其黄芪组促进增殖作用最强,各组的作用强度顺序为黄芪血清组>归芪1:5血清组>归芪1:1血清组>正常血清组>当归血清组>无受试血清组。但4个给药组之间并没有明显的统计学差异。从当归血汤两组的药效作用强度分析,似由当归、黄芪药效的相加而得。
无外源性刺激因子对红系祖细胞的影响:结果为阴性对照(无受试血清)CFU-E(6)为0,BFU-E(6)为0;正常血清组分别为40.3±5.1,3.0±2.0;当归血清组分别为78.0±21.61,6.5±0.5;黄芪血清组分别为108.3±25.3,6.6±0.4;归芪1:5分别为107.0±20.9,6.5±0.3;归芪1:1分别为67.3±6.1,6.0±1.0。在无外源性刺激因子的培养体系中不加任何受试血清或药物,红系造血祖细胞不能生长增殖。加入小鼠正常血清,红系造血祖细胞可以增殖,CFU-E的克隆数值比BFU-E的大得多,说明小鼠血清内含有EPO的量比IL-Ⅲ的量大得多。而口饲各受试药小鼠的含药血清与正常血清比较对CFU-E和BFU-E的增殖作用有明显差异,其差值为药效强度。在无外源性刺激因子的情况下,药效作用十分明显,表现在促进红系祖细胞增殖的提高百分率大多在1倍以上,尤以黄芪组和当归补血汤归芪1:5组和1:1组间有明显差异P<0.01,1:5组比1:1组作用明显增强。
1.2 对造血祖细胞(CFU-GM)的影响
张英华等以当归补血汤水煎剂(当归:黄芪=1:5)6.6、13.2、19.8g/kg灌胃小鼠1次,1h后采集腹主动脉的血清0.4ml,加入小鼠造血祖细胞体外培养体系中培养6d,观察对CFU-GM的影响,结果:随给药剂量的增加CFU-GM集落数增多,其量效方程为Y=-98.93+159.66log X,最低起效量为4.17g饮片/kg。拆方研究表明促进CFU-GM增生功效的顺序是当归1.32g/ml>当归0.22g/ml≥当归补血汤1.32 g/ml>对照≈黄芪1.10g/ml>黄芪1.32g/ml。可见黄芪在当归补血汤中的作用有可能是促进红系的增殖活性^[13]。
当归补血汤按当归黄芪1:5水煎两次,煎液过滤,混合浓缩至1.32g/ml,做为小鼠口服药。将药液离心,取其上清液,高压灭菌后做为受试药Ⅰ。
服药后血清的制备:小鼠口服当归补血汤等各受试药或等体积水0.1ml/10g体重,药后1h小鼠吸入乙醚麻醉,无菌条件下腹主动脉取血,离心取血清,做为受试药Ⅱ。
空白血清的制备:口饲小鼠同给药组等体积的水,同上法制备血清,做为空白对照血清。
小鼠造血祖细胞的获取:在无菌条件下取出小鼠股骨,用1640培养液冲出骨髓,用白细胞计数法计数有核细胞,调整细胞悬液中有核细胞量,使培养体系中的有核细胞为105个/ml。
CFU-GM体外培养体系:某一给药浓度或某一给药时间点CFU-GM的培养为一个培养体系,总体积7.6ml,包括1640培养液4ml,造血祖细胞悬液0.4ml,马血清2ml,CSF0.5ml,5%琼脂0.4ml,受试药0.1～1.0ml,用1640液调整,使体系总体积不致因受试药体积的不同而改变。
CFU-GM体外培养:将上述体系加入直径为3cm的玻璃培养皿中,每皿1ml,每一体系做6个皿,放入CO2培养箱中,37℃、5%CO2饱和湿度下培养6d。
CFU-GM计数:多于50个细胞的克隆单位为一个集落,在10×4倍光镜下计数全皿集落并取6个皿的平均数值,每1试验均重复3次。
1.2.1 受试药Ⅰ、Ⅱ对CFU-GM影响的比较
在实验条件下,培养体系只加入CSF(小鼠肌浸液),不加任何受试药,CFU-GM集落的均数为80±12,做为阴性对照。培养体系中加入不同量的受试药液Ⅰ,药量为20、40、80、100、150、200、300μl,随药物浓度的增加,CFU-GM数逐渐减少,依次为78.88、62.75、26.38、9.23、3.78、1.00、0.00表明当归补血汤直接用于体外培养时,对CFU-GM有明显的抑制作用。在培养体系中加入不同浓度的含当归补血汤血清,即口饲当归补血汤煎剂13.2g/kg后1h取得的含药血清,对应每个浓度的含药血清体系再做一个相同血清浓度的空白血清体系,结果表明空白血清含有CSF活性,能提高CFU-GM数量,而相同浓度的含药血清刺激CFU-GM生长的能力比空白血清更强,含药血清的加入量为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml,随药物浓度的增加,CFU-GM数逐渐增加,依次为7.5、14.75、39.81、81.33、91.67、109、86。当体系中总血清浓度(受试血清和马血清)达到35%～40%后,再增加含药血清浓度,CFU-GM数量不再增加,反而下降,这可能由于体系中血清浓度过高抑制细胞生长所致。
1.2.2当归补血汤对CFU-GM影响的药效动力学研究
给小鼠1次口饲13.2g/kg的当归补血汤,给药后不同时间采集血清,各时相的培养体系中均加入该时的含药血清0.6ml,同时设空白血清体系为对照,所有体系都不加刺激因子CSF,各时相含药血清体系的CFU-GM集落数减去对照体系的集落数,为当归补血汤对CFU-GM影响的效应数值,用采血时间和含药血清影响CFU-GM集落生长数值作时一效曲线,该曲线表明药效动力学应按非血管给药的一室拟合方法求解药效动力学参数。
取清除相6、8、10、12时间点,以直线回归法得效应消除方程Y=2.2681-0.172t,消除速率常数Ke=0.3961/h。效应消除半衰期T1/2(Ke)=1.7496h。取效应呈现相2、3、4三个时间点,以残数法得效应呈现方程Y=0.5815-0.5828t。效应呈现速率常数Ka=1.3422/h。效应呈现半衰期T1/2(Ka)=0.5163h。效应达峰时间Tp=1.5798h。效应维持时间Td=14.8019h。
张氏又观察发现:当归补血汤煎液对小鼠粒系-巨系造血祖细胞(GFU-GM)的生长有抑制作用,剂量越大,抑制作用越强。当归补血汤口饲小鼠后的含药血清对GFU-GM的生长有明显的激活作用,剂量越大,GFU-GM集落生长的越多。小鼠含药血清在相同含药血清浓度下,时效关系求出了当归补血汤的药效动力学参数(Ke、T1/2Ka、Ka、T1/2ka、Tp、Td)^[14]。
1.3对正常小鼠红细胞、血红蛋白的影响
按5:1比例,分别取黄芪与当归一定量,在同一实验条件下,分别制成单煎与混煎液。小鼠18～22g,雄性,为昆明种。取小鼠40只,随机分成4组,给药组按15、3与18g/kg剂量(人用剂量25倍)分别取黄芪、当归与当归补血汤,每天给小鼠口服灌胃给药1次,对照组口服同体积生理盐水,连续10d,于给药前与末次给药后1h,尾静脉采血,按常规方法,测其红细胞数与血红蛋白浓度,其结果见表12-16-9。

表12-16-9 当归补血汤对正常小鼠红细胞、血红蛋白的影响

组别 动物数
(只) 给药前 给药后 RBC Hb RBC Hb 空白对照组
黄芪组
当归组
当归补血汤组 10
10
10
10 510±30
509±42
502±36
495±29 14.9
14.8
14.6
14.4 526±37
551±38
543±41
599±49 15.3
16.1
16.0
17.5

表12-16-9结果得知,与给药前比较,当归补血汤组显著提高小鼠细胞数与血红蛋白浓度(P<0.01),而黄芪与当归组虽有一定作用,但与对照组比,无统计学意义^[15]。
1.4 对贫血动物模型的作用
1.4.1 对照射加苯肼贫血模型的影响^[15]
选取健康小鼠40只,X线1次照射600拉德,第2天,对每只照射小鼠腹腔注射0.2 ml苯肼液(60mg/kg),注射后第8 d,随机分成4组,给药组按16、3与18 g/kg剂量,给贫血小鼠分别口服黄芪、当归与当归补血汤1次,连续10日,于给药前与末次给药后1 h,测其红细胞数与血红蛋白浓度,结果见表12-16-10。

表12-16-10 当归补血汤对苯肼致小鼠贫血模型的影响

组别 动物数
(只) 给药前 给药后 RBC Hb RBC Hb 空白对照组
黄芪组
当归组
当归补血汤组 10
10
10
10 380±41
395±39
399±28
410±37 11.0
11.5
11.6
12.0 420±41
510±27
498±31
549±40 12.2
14.8
14.5
16.0

表12-16-10 说明,当归补血汤、黄芪与当归组能促使贫血小鼠的红细胞再生,但当归补血汤组较单纯当归与黄芪组补血为佳,即气血双补较之单纯补气与单纯补血养血为好。
1.4.2 对乙酰苯肼致贫血模型的影响^[16]
选25～30 g雄性健康小鼠和2.5～3kg家兔,用2%乙酰苯肼注射液小鼠0.3 ml皮下注射,家兔0.5ml/kg肌肉注射,共2次,建立溶血性贫血模型为实验对照组。另一组小鼠同时肌注鹿茸精注射液,每日1次,每次0.15ml。另一组家兔同时注射人参注射液(红参0.5g/ml),鹿茸精注射液,当归补血汤(黄芪:当归5:1),分别以1 ml/kg肌注,每天一次,共6d,为实验组。结果见表12-16-11,表12-16-12和表12-16-13。

表12-16-11 正常组和溶血性贫血组红细胞、血红蛋白比较(±s)

　 正常鼠组 溶血性贫血鼠组 P值 正常兔组 溶血性贫血兔组 P值 红细胞(万/mm3)
血红蛋白(g/100ml) 941±0.985
13.67±1.253 214.52±81.72
3.426±1.304 <0.001
<0.001 533±65.97
12.01±1.133 167±37.66
5.31±0.37 <0.001
<0.001

表12-16-12 贫血组(鼠)与鹿茸组(鼠)红细胞、血红蛋白比较(±s)

组别 红细胞(万/mm3) 血红蛋白(g/100ml) 溶血性贫血组
鹿茸组 214.52±81.72
366.72±99.33** 3.426±1.304
8.012±1.948**

与模型组比:* * P<0.01

表12-16-13 贫血组(兔)与人参、鹿茸、当归补血注射液组红细胞和血红蛋白比较(±s)

组别 红细胞(万/mm3) 白红蛋白(g/100ml) 溶血性贫血组
人参组
鹿茸组
当归补血汤组 167±37.665
239.5±73.55**
250±72.16**
226±67.47** 5.31±0.37
6.18±0.82**
6.47±0.05
6.11±1.10**

与模型组比较:* * P<0.01
贫血组与药物治疗组肝、脾形态学和脾铁反应观察:溶血性贫血组鼠、兔肝的H.E切片中均有红细胞破坏证据,胆色素增加,脾脏明显增大,镜检有较多的吞噬细胞。经鹿茸治疗后肝中胆色素明显减少,脾体积明显减小,仅见少量吞噬细胞。人参组、当归补血汤组兔肝、脾的胆色素及脾吞噬细胞也都减少,但没有鹿茸组明显。脾铁反应,贫血组呈⫵→⫲;鹿茸组呈±→+;人参组⫲→+,当归补血汤呈+ +。骨髓H.E切片,贫血组鼠骨髓中细胞成分增多,脂肪细胞明显减少,在100/0→98/2范围内,有造血细胞增生现象,鹿茸治疗后一般在98/2→95/5范围,有逐渐恢复趋势。
贫血组和人参、鹿茸、当归补血汤组微循环改变:正常鼠、兔耳微循环视野清晰,流态持续,混悬均匀,血色呈红色,无渗出,出血。溶血性贫血鼠耳、肝、肾、肠系膜及兔耳中均见流态虚线状,流速减慢,血呈淡红色,有片状渗出,视野较模糊,在肝、肾中有明显颗粒状物积聚。经鹿茸精治疗后,鼠、兔的微循环有明显好转,视野清晰,片状渗出基本消失,血呈红色或暗红色,混悬度均匀,流态持续,颗粒状物积聚明显减少。人参组、当归补血汤组微循环有一定改善,但没有鹿茸组那样明显。
1.4.3对烷化剂致造血功能损伤模型的影响
ICR小鼠随机分组:当归补血汤煎液(含当归0.06g/ml、黄芪0.3g/ml)、当归液(1g/ml)、黄芪(1g/ml)组以及对照组(水)。各组给予灌胃,按0.6ml/只,每日2次,连续7d。给以烷化剂造成动物造血功能受损模型。制备脾条件培养液(SCMs)、肺条件培养(LCM)及骨髓细胞悬液,测定克隆刺激因子(CSFs)活性。结果:当归补血汤能显著促进正常小鼠SCM、LCM和血虚小鼠SCM中的CSMs的产生(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。当归和黄芪则分别促进和抑制正常小鼠SCM中的CSFs产生。提示当归补血汤的补血作用与其刺激CSFs分泌有关,且系当归的作用所致^[17]。
1.4.4对失血性贫血模型的影响
按黄芪50g,当归10g,加水600ml煎煮,时间15、30、45、60min,二煎时间为头煎的1/2。不同煎煮时间的煎出液对小鼠失血性贫血模型的的实验表明,当归补血汤煎煮45min和90min的煎出液均能明显升高失血性小鼠的RBC与WBC总数,且90min煎液升高红细胞作用优于45min,对白细胞的升高作用二者无差异^[18]。
1.4.5对青蒿琥酯致网织红细胞降低的影响^[19]
李爱瑗进行实验表明,当归补血汤、四物汤、当归注射液以及维生素E注射液对青蒿琥酯所致网织红细胞降低均有一定防治效果,尤以四物汤疗效最好(P<0.01)。
2.对心血管的作用
2.1 对心肌能量代谢的影响
以本方1000g/L的煎液按0.2ml/10g给小鼠灌胃,连续7d,次日将小鼠处死,取心脏,测心肌cAMP和cGMP的含量,结果表明,较之对照组,本方组可非常显著增加小鼠心肌cAMP含量(P<0.01),对cGMP无显著作用。同时,本方明显提高cAMP/cGMP的值。证型研究发现:cAMP和cGMP是一对自成系统的阴阳协调物,一般情况下,cAMP/cGMP的值升高为阳,降低为阴。补阳药可显著提高阳虚患者明显降低的cAMP/cGMP的比值。实验结果为当归补血汤补气(阳)作用提供了客观了依据。推测由于心肌内cAMP浓度增加,激活了cAMP的蛋白激酶,使钙通道激活,钙的内流加速;同时细胞内cAMP增加也促使肌浆网释放钙,从而加强了心肌细胞的兴奋-收缩耦联过程,从而发挥正性肌力作用^[20]。
2.2对体外培养心肌细胞的作用
2.2.1 对缺糖缺氧所致心肌损伤的影响
实验分为缺糖缺氧组,即换入无糖无氧的Eagle培养基;有糖有氧对照组,即换入有糖有氧的Eagle培养基;缺糖缺氧加当归补血汤组、缺糖缺氧加当归组、缺糖缺氧加黄芪组。置37℃培养6h后,分光光度法测定培养基中的LDH、结果见表12-16-14。

表12-16-14 当归补血汤、当归、黄芪对心肌细胞LDH漏出的影响

组别 剂量(mg/ml) 数量(瓶) LDH(u,m±s) P LDH漏出减少百分率(%) 当归补血汤组 15
20 10
10 272.4±15.01
253.1±26.77 <0.001
<0.005 23.72
29.12 有糖有氧组
缺糖缺氧组　 10
10 72.3±9.54
357.1±13.78 <0.001 79.75 生黄芪组 10
15
20 7
25
21 122.71±5.15
99.04±7.12
98.04±7.12 >0.1
<0.001
<0.001 16.69
32.76
33.44 有糖有氧组
缺糖缺氧组　 27
28 80.29±4.80
147.30±8.30 <0.001 45.49 当归组 10
15 14
13 89.93±5.63
96.38±11.59 <0.001
<0.01 37.89
33.43 有糖有氧组
缺糖缺氧组　 14
14 75.86±7.66
144.79±11.58 <0.001 47.61

体外培养乳鼠心肌细胞在缺糖缺氧条件下心肌细胞受损而释放LDH,因此可测定培养基内的LDH以代表心肌受损情况。结果表明:当归补血汤、当归、黄芪都能保护缺糖缺氧致心肌细胞损伤,减少LDH的漏出。在保护程度上黄芪和当归LDH漏出减少百分率略高于当归补血汤^[21]。
2.2.2 对培养心肌细胞搏动频率和强度的影响^[22]
心肌细胞培养方法同上,使细胞浓度达到1×106/ml,取培养3～4d的心肌细胞,在带有恒温(34～35℃)装置的倒置显微镜下选择搏动规律的细胞团做实验对象,待搏动正常后,用心电图机描记心肌细胞搏动频率、强度,然后用微量进样器加入药物,给药后不同时间进行描记,并设Eagle和空白对照组,以给药前搏动频率为100%,计算给药后不同时间搏动频率变化的百分率,并计算细胞团收缩的振幅值,求出搏动强度,结果见表12-16-15和表12-16-16。

表12-16-15 当归补血汤、当归、黄芪对心肌细胞搏动频率的影响(±s)

组别 数量
(瓶) 给药前搏动频率
(次/min) 给药后搏动频率(次/min) 15min 变化率(%) 20min 变化率(%) 当归补血汤
当归
黄芪
Eagle
空白 7
7
5
5
7 38.86±3.16
41.14±19.74
45.4±12.92
29.8±7.85
24.71±11.77 26.29±3.74
47.0±21.51
30.60±8.81
37.8±9.64
30.14±37.2 -32.35
12.47
-32.60
26.85
21.07 31.33±4.21
46.0±20.61
27.0±6.83
40.40±11.43
29.57±4.25 -19.38
10.57
-40.53
35.57
19.67

“-”表示减慢频率
从表12-16-15看出,给当归补血汤15 min后,对培养心肌细胞搏动频率(自身比较)有减慢的作用(32.35%),20 min后减慢为19.38%;Eagle和空白15 min后对心搏动频率有加快的作用,分别加快为26.85%和21.97%,20 min后,Eagle加快35.57%,空白加快19.67%。

表12-16-16 当归补血汤、当归、黄芪对心肌细胞搏动振幅的影响(±s)

组别 数量
(瓶) 给药前搏动振幅
(mv) 给药后搏动振幅(mv) 15min 变化率(%) 20min 变化率(%) 当归补血汤
当归
黄芪
Eagle
空白 7
6
5
5
7 5.12±0.73
6.93±1.97
4.70±0.66
8.24±1.79
6.95±1.17 6.52±0.91
7.18±1.96
5.94±0.37
7.90±1.81
6.78±1.02 27.34
3.61
26.38
-4.17
-2.45 7.54±1.34
6.48±1.51
5.74±0.55
7.70±1.68
7.38±1.06 47.27
-6.49
22.13
-6.55
6.19

“-”表示降低振幅
从表12-16-16看出,给当归补血汤15min后,对培养心肌搏动振幅增高27.34%;20min增高47.27%,而Eagle和空白15min后对培养心肌细胞搏动振幅分别减低为4.13%和2.45%;20min后,Eagle对培养心肌细胞搏动振幅减低6.55%,但空白增高6.19%。
结果表明:当归补血汤、黄芪有减慢心肌细胞搏动频率的作用,而当归则增加心肌细胞搏动频率。当归在给药前后心肌细胞团收缩的幅值无大变化,黄芪使心肌细胞团收缩幅值增强为22.1%,而当归补血汤组心肌细胞团收缩幅值为47.3%,提示当归补血汤能增强心肌细胞收缩功能。
2.2.3细胞内LDH的细胞化学定性观察^[22]
取盖玻片条上培养8d的心肌细胞,随机取样分别进行实验,在同一染色缸内作细胞化学LDH定性显示观察,结果见表12-16-17。

表12-16-17 当归补血汤对培养乳鼠心肌细胞缺糖缺氧性损伤的保护影响(±s)

组 别 损伤程度(m±s) P值 有糖有氧组
n=10 Ⅰ类细胞
Ⅱ类细胞
Ⅲ类细胞 60.45±3.16
26.68±3.16
12.88±3.16 <0.01 缺糖缺氧组
n=10 Ⅰ类细胞
Ⅱ类细胞
Ⅲ类细胞 23.78±3.16
21.45±3.16
57.22±3.16　 当归补血汤组
2000μg/ml
n=10 Ⅰ类细胞
Ⅱ类细胞
Ⅲ类细胞 46.55±3.16
30.38±3.16
23.08±3.16 <0.01 当归补血汤组
1500μg/ml
n=10 Ⅰ类细胞
Ⅱ类细胞
Ⅲ类细胞 36.33±3.16
35.10±3.16
27.88±3.16 <0.05

缺糖缺氧加当归补血汤组无论大剂量或小剂量组的心肌细胞内LDH活性Ⅱ类细胞比有糖有氧对照组略少,但比缺糖缺氧组明显增多。大剂量(2000μg/ml)给药组的心肌细胞结构与有糖有氧组相似,细胞核及核膜界清楚,LDH颗粒丰富,而且染色清晰,分布均匀,呈深紫蓝色反应,缺糖缺氧组细胞形态结构被破坏,细胞脱壁,胞核和胞质模糊不清,LDH颗粒明显减少,分布也不均匀,染色变浅且淡,缺糖氧加小剂量(1500μg/ml)组的心肌细胞结构在二者之间,细胞内的LDH活性比有糖有氧组的反应弱,但比缺糖缺氧组活性反应强。
2.2.4 对培养心肌细胞超微结构的影响^[23]
本药对培养心肌细胞缺糖缺氧损伤产生的一系列超微结构形态学改变具有改善作用。无糖无氧组心肌细胞镜下观察到细胞有水肿,核出现畸型,呈固缩状改变,核内染色质凝集呈不规则的物质分布,线粒体肿胀,嵴短而少,排列不规则,部分线粒体空泡变性,嵴消失,双层膜变成单层膜,糖原颗粒减少,闰盘结构改变。心肌细胞虽然出现收缩部分,但肌浆内肌微丝组成肌原纤维有些区域偶见区膜和A带,Ⅰ消失,并排列紊乱,局部似有断裂破裂,说明肌原纤维结构被破坏。无糖无氧加本药组,心肌细胞大部分细胞核尚正常,少数核粒稍有内褶,染色质均一分布。线粒体嵴密集,仅部分线粒体肿胀、嵴少,粗面内质网及糖原颗粒丰富;心肌细胞出现收缩部分,肌浆内可见肌微丝组成肌原纤维,并形成的肌小节,排列规则,Z膜、A带和Ⅰ带清晰可见,局部未见断裂和破碎。肌原纤维周围和附近有较多簇状糖原颗粒及散在粗面内质网,说明心肌细胞收缩功能良好。
结果表明当归补血汤、当归、黄芪对心肌细胞确有保护作用,其机制可能是通过稳定心肌细胞膜,减少LDH的漏出,保护线粒体及溶酶体的功能,增加抗缺氧的能力,从而保护心肌细胞,减轻心肌细胞损伤程度。三者似以黄芪、当归效果略好,而当归与黄芪混合,则可使心肌细胞收缩的振幅明显增强,即能加强心肌收缩能力,这可能是黄芪配伍当归起到相辅相成的效果。
2.3 对心肌缺血再灌注损伤的保护作用^[24]
取Wistar大鼠48只,220±30g,雌雄兼用,随机等分为4组,前3组为给药组,分别给以芪归药对不同用量比例的水煎液灌胃(芪归之比分别为5:1;1:1;1:5),剂量皆为12g生药/kg;空白对照组给以等容量生理盐水,每天1次,连续6d。于末次给药后1h,腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg麻醉,开胸,结扎左冠脉前降支1h,剪断结扎线,恢复血液灌注30 min。再灌注结束即刻断头取血,制备血清,测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。取出心脏,用0.125% NBT染色,非梗死区被染为深蓝色,梗死区不着色。将梗死心肌剪下,称湿重,以梗死区湿重占全心湿重的百分比表示心肌梗死范围。
2.3.1 对大鼠心率的影响:将结扎冠脉前的大鼠心率作为标准值100,将结扎后各时点实际心率与结扎前实际心率相比较,得到各时点的相对心率,如表12-16-18所示。由表可见,结扎冠脉后各组动物心率均呈下降趋势。与对照组比较,三个给药组心率下降幅度均显著大于对照组(P<0.01)。其中芪:归为1:5组降低心率作用最显著,5:1组次之,1:1组又次之。

表12-16-18 黄芪当归不同用量比例对大鼠心肌缺血再灌注损伤相对心率的影响

　 药物
(芪:归) 动物
数(只) 冠脉
结扎前 冠脉结扎后 缺血再灌注 即刻 30min 60min 即刻 3min 30min 1
2
3
4 5:1
1:1
1:5
N.S 9
9
11
7 100
100
100
100 104.1±9.9
103.6±10.8
99.0±3.3
114.4±5.8 93.1±9.3
95.0±7.9
88.2±7.4
105.7±4.0 86.7±13.0
89.6±7.6
82.7±9.3
99.8±7.9 85.0±13.7
88.3±8.4
82.3±9.8
96.8±7.3 84.9±14.3
85.4±8.4
80.9±9.7
97.9±11.4 78.4±15.9
83.2±10.6
77.3±12.0
95.1±10.2

注:①各时点给药组分别与N.S组比较,皆P<0.01;②除结扎后即刻1与2比较P>0.05,再灌后30min, 1与2比较P>0.05,再灌后30 min, 1与2比较P>0.05外,其余各时点1、2、3组分别进行两两比较,皆P<0.01
2.3.2 对大鼠心肌缺血性心律失常的作用:大鼠实验性急性心肌缺血,其心电图可出现特征ST-T变化和各种心律失常,为较敏感而可靠的实验观察指标。正常情况下,大鼠ST段呈RS-T型,在Ⅱ导联ST段常略有高。实验中观察到,结扎左冠脉前降支后,可见ST段弓背上抬、T波逐渐高耸,少数动物先见ST段下移之后又上抬,整个缺血期缺血性ST-T变化非常显著。剪断结扎线后,各组升高的T波、ST段均有降低,说明再灌注模型成功。在再灌注期,各组动物ST-T又有所抬高,有的抬高程度甚至高于缺血期。芪归药对对大鼠因再灌注过程中ST段变化值的影响见表12-16-19,表12-16-20。

表12-16-19 黄芪当归药对不同用量比例对大鼠缺血期心电图ST段变化值的影响(±s)

　 药物
(芪:归) 动物数
(只) 手术前ST段
高度(mv) 结扎后ST段变化值(|结扎后ST段值-结扎前ST段值|) 5s 30min 60min 1
2
3
4 5:1
1:1
1:5
N.S 10
9
11
12 0.198±0.053
0.197±0.092
0.152±0.064
0.181±0.070 0.167±0.107
0.150±0.092
0.138±0.070△
0.248±0.120 0.183±0.105△
0.229±0.100
0.210±0.095
0.277±0.085 0.158±0.090△△
0.207±0.101
0.181±0.099△
0.295±0.088

注:药物组与N.S组比较:△P<0.05,△△P<0.01

表12-16-20 黄芪当归药对不同用量比例对大鼠再灌注期心电图ST段变化值的影响(±s)<

p align="center">

　 药物
(芪:归) 动物数
(只) 手术前ST段
高度(mv) 再灌注期ST段变化值(|再灌后ST段值-结扎前ST段值|) 5s 30min 60min 1
2
3
4 5:1
1:1
1:5
N.S 10
9
11
12 0.198±0.053
0.197±0.092
0.152±0.064
0.181±0.070 0.088±0.057
0.119±0.081
0.112±0.060
0.114±0.077 0.100±0.065△△
0.106±0.074△
0.118±0.060△
0.212±0.108 0.097±0.073△
0.071±0.062△△
0.065±0.056△△
0.178±0.067

注:①药物组与N.S组比较:△P<0.05,△△P<0.01,;②结扎前各组ST段高度分别进行组间比较,均无统计学意义(P>0.05);③缺血再灌注过程中,各时点的ST段变化值,1、2、3分别组间比较,均无统计学意义(P>0.05)
结扎冠脉造成心肌缺血后可出现明显的室性位心律,包括室性早搏、阵发性室性心动过速和室性纤维颤动。实验观察到,结扎冠脉后各组动物均有发生心律失常者,以生理盐水组发生率高且严重。以因出现室颤而导致动物死亡为例,生理盐水组有结扎即刻至8min即出现室颤而有死亡现象,而三个给药组多延至16～20min才出现室颤,且室颤致死率略低于生理盐水组(致死性室颤出现率分别为12.5%、16.7%、11.8%、17.7%),但无统计学意义(P>0.05)。
结扎冠脉后一定时间,剪断结扎线恢复冠脉灌注后约20s即可发生心律失常,表现为室早、室速、室颤及房室传导阻滞等,心律失常严重程度与冠脉结扎时间有关。结扎时间短于2min或长于20min,心律失常严重程度降低,不发生室颤。实验确定缺血1h,再灌30min,在再灌注期可见到室早(VP)、室速(VT)等异位心律,基本未见到室颤。该药对对大鼠缺血再灌注心律失常的影响见表12-16-21。

表12-16-21 芪归药对对大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影响

　 药物(芪:归) 动物数(只) VP(%) VT(%) 总发生率(%) 1
2
3
4 5:1
1:1
1:5
N.S 10
9
11
12 45.5
55.6
27.3
41.7 36.4
33.3
27.3△
61.5 63.6
66.7
36.4△
84.6

注:药物组与N.S组比较:△P<0.05
2.3.3 对大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死范围的影响:芪归药对的三个不同用量比例组,均能显著缩小大鼠实验性心肌梗死面积(IS),与生理盐水组比较,均有极显著意义(P<0.01)。其中,以1:5组作用最好,5:1组次之,1:1组又次之,见表12-16-22。

表12-16-22 不同用量比例芪归药对对大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死范围的影响(±s,%)

　 药物(芪:归) 动物数(只) IS P 1
2
3
4 5:1
1:1
1:5
N.S组 10
9
11
12 19.39±7.70
21.53±5.83
15.84±5.89
33.66±4.79 <0.001
<0.001
<0.001
—

注:1组与2组比较:P>0.05;1组与3组比较,P>0.05;2组与3组比较,P<0.05
对血清中SOD、MDA及GSH-Px的影响:如表12-16-23所示,该药对的三个比例组均可显著升高大鼠缺血再灌注后血清中SOD活性,(与生理盐水组比较,皆P<0.05);均可显著降低MDA含量(与生量盐水组比较,P<0.05～0.01);对GSH-Px活性的影响,三个给药组分别与生理盐水组比较,皆无显著性差异(P>0.05)。

表12-16-23 芪归药对不同比例对大鼠心肌缺血再灌注后血清SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性的影响(±s)

　 药物(芪:归) 动物数(只) SOD(Nu/ml) MDA(nM/ml) GSH-Px(活力单位) 1
2
3
4 5:1
1:1
1:5
N.S 10
9
11
12 395.83±97.11*
402.48±86.13*
398.23±85.78*
304.99±102.73 4.03±1.07**
4.41±0.85*
4.15±0.93**
5.50±1.22 100.54±9.15△
100.05±9.06△
96.12±9.94△
97.80±8.36

注:①与生理盐水组比较:*P<0.05,**P<0.01;②SOD、MDA、GSH-Px三项指标,药物组分别进行两两比较,皆P>0.05
2.4 对心功能的影响
当归补血汤水煎浓缩液按5～29g/kg经十二指肠给药,能显著提高10%乌拉坦10ml/kg腹腔注射麻醉的大鼠的收缩压、舒张压和平均压。对心率无明显影响。10g/kg能提高心肌张力-时间指数^[25]。
3.对血液流变学的影响^[26]
药物:100%黄芪水煎液、100%当归水煎液、50%黄芪水煎液+50%当归水煎液、黄芪多糖液(每毫升含量与1 ml黄芪水煎液中相当)、阿魏酸液(每毫升含量与1ml当归水煎液中相当)。
3.1 对正常大鼠全血比粘度、血浆比粘度的影响
取SD大鼠48只,随机分成6组。分别灌胃相应药液或生理盐水,每天1次,共8d,末次给药后1 h,以25%乌拉坦麻醉。腹主动脉取血,置肝素管中抗凝,用毛细管测定方法测定全血比粘度,全血离心后,吸取上层血浆测定血浆比粘度。结果:所有给药组均能增加正常大鼠的全血比粘度,其中黄芪水煎液、黄芪当归煎液、黄芪多糖液的作用最显著(P<0.01)。黄芪水煎液、黄芪当归液能减低血浆粘度升高(P<0.05),而阿魏酸液则使血浆粘度升高(P<0.05)。见表12-16-24。

表12-16-24 黄芪、当归及含量对正常大鼠全血比粘度和血浆比粘度的影响(±s)

组别 剂量
(ml/kg×d) 给药
途径 全血比粘度 血浆比粘度
(mPa·s) 高切(mPa·s) 低切(mPa·s) 对照
黄芪水煎液组
黄芪+当归液组
当归水煎液组
阿魏酸液组
黄芪多糖液组 20×8
20×8
20×8
20×8
20×8
20×8 ig
ig
ig
ig
ig
ig 9.62±1.29
14.82±1.19**
15.07±1.27**
14.65±1.27**
13.91±2.14**
16.08±1.96** 19.52±2.30
31.61±3.66**
28.97±2.78**
31.73±8.38**
35.04±2.46**
41.81±7.76** 1.656±0.033
1.561±0.072*
1.599±0.046*
1.660±0.100
1.770±0.083*
1.670±0.063

与对照组比较:* P<0.05,* * P<0.01;ig:灌胃
3.2对血虚模型大鼠全血比粘度、血浆比粘度的影响
取SD大鼠56只,随机分成7组,分别灌胃相应药液或生理盐水,每天1次,共8d。末次给药后1h,以25%乌拉坦麻醉,腹主动脉取血。全血比粘度、血浆粘度的测定方法同上。结果大鼠皮下注射乙酰苯肼而造成溶血性血虚模型之后,全血比粘度(高切和低切)明显低于正常对照组,而血浆比粘度则无明显影响。给药后黄芪水煎液、黄芪当归液能使模型组的全血比粘度(高切和低切)升高(P<0.05),黄芪当归液、当归液、阿魏酸液能升高模型组的血浆比粘度。见表12-16-25。

表12-16-25 黄芪、当归及合方对血虚大鼠全血比粘度和血浆比粘度的影响(±s)

组别 剂量
(ml/kg×d) 给药
途径 全血比粘度 血浆比粘度
(mPa·s) 高切(mPa·s) 低切(mPa·s) 对照
模型
黄芪水煎液
黄芪+当归
当归水煎液
阿魏酸液
黄芪多糖液 20×8
8.4(d1.4)
20×8
20×8
20×8
20×8
20×8 ig
sc
ig
ig
ig
ig
ig 10.71±1.36
5.81±0.66△△
7.45±1.26*
7.45±1.53*
6.17±1.85
5.92±0.95
6.17±1.31 22.30±3.18
9.05±1.87△△
12.52±2.39*
11.64±2.37*
9.35±1.85
9.25±1.89
9.56±2.74 1.625±0.080
1.637±0.047
1.645±0.046
1.774±0.081**
1.763±0.116*
1.726±0.055*
1.652±0.040

与模型组比较:* P<0.05,* * P<0.01;与对照组比较:△△P<0.01;sc:皮下
4.对凝血功能的影响^[27]
4.1 对正常人体外血小板聚集性的影响
健康受试者共8人,男性5名,女性3名,年龄为18～34岁,26.0±6.23岁。采血前未服过影响血小板聚集性的药物。取血制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP),在2h内实验完毕。实验时按表12-16-26所示的分组,分别加入不同浓度的当归补血汤水提物和潘生丁注射液,对照组则加入等容积的磷酸缓冲液(pH7.4)。由于当归补血汤水提物与潘生丁注射液均有颜色,故贫血小板血浆管亦放入与富血小板血浆管相应的等容积的药物,然后置入血小板聚集仪保温孔内3min。诱聚剂ADP均加入3μM,实验观察5min,所得数据经微机处理后,打印出1min聚集率[AGG(1)]和5min聚集率[AGG(5)]。结果见表12-16-26。

表12-16-26 当归补血汤对正常人血小板聚集性的影响

组别 例数 药物浓度(mg/L) 1min聚集率 抑制率 5min聚集率 抑制率 对照组 8 0 61.6±15.1　 74.9±14.8　 潘生丁组
当归补血汤组
当归补血汤组 8
8
8 250
17.5
8.75 26.6±14.2
17.8±16.5
19.5±14.7 57.2±19.2**
74.1±20.2**
69.6±20.1** 16.4±15.9
14.4±21.6
18.4±23.5 79.2±17.7**
83.8±23.8**
78.9±23.2**

与对照组比较:**P<0.01
结果表明:当归补血汤水提物两种不同浓度与对照组比较,均有非常显著地抑制血小板聚集率作用,两剂量组作用比较均无显著差异,与潘生丁组比较差异也不显著。
3 min聚集率[(R)3],8名受试者中,对照组没有1例出现解聚。当归补血汤水提物17.5mg/L组有5例发生解聚,(R)3为76.6±19.7,其中有二例虽没有解聚,但本身聚集率已很低(均为AGG(1)8.65,AGG(5)5.4)。8,75 mg/L组中7例解聚,(R)3为52.0±27.6。潘生丁组也有7例解聚,(R)3为57.6±32.0。提示该方有较好地促进解聚的作用。
4.2 对正常大鼠体外血小板聚集的影响
SD大鼠,雌雄不拘,体重264.4±18.1 g,乌拉坦麻醉,腹主动脉取血,制备PRP和PPP,PPP浓度为4.0×105/μl,按表12-16-27所示分组,各组分别加入不同浓度的药物,结果见表12-16-27。

表12-16-27 当归补血汤对正常大鼠血小板聚集性的影响

组别 例数 药物浓度(mg/L) 1min聚集率 抑制率 5min聚集率 抑制率 对照组 9　 47.4±20.5　 73.2±17.4　 潘生丁组
当归补血汤组
当归补血汤组 9
9
5 250
70
35 19.7±15.5
6.2±9.8
21.6±12.1 48.7±35.1*
84.0±24.6**
58.2±27.2* 32.4±31.9
11.1±14.5
29.9±20.5 58.7±35.3**
86.8±17.5**
40.7±12.8**

与对照组比较:* P<0.05,**P<0.01
当归补血汤对正常人和大鼠血小板聚集性均有非常显著地抑制作用。并且对血小板的Ⅰ相与Ⅱ相聚集均有抑制作用,提示该方既能抑制外源性ADP的诱聚作用,亦抑制血小板自身的释放功能,此外该方还有较好地促解聚作用。这些作用可能对预防血栓形成,降低血液粘度,加快血流,从而改善血液对全身组织器官的供应有好处。
5.抑制血栓形成的作用^[28]
当归补血汤水提醇沉注射液制备,将原方当归、黄芪二药混合煎煮2次,每次90min。两次水煎液混合过滤、浓缩,加入等量的95%乙醇拌匀,放置24h后,离心沉淀,取上清液于100℃水浴浓缩去醇。然后加蒸馏水溶解制成含生药1.44g/ml的注射液,高压灭菌备用。当归、黄芪均按同法制备成含生药量0.24g/ml当归注射液、含生药量1.2g/ml黄芪注射液。大鼠60只,分为当归补血汤组、当归组、黄芪组,每组20只。以自身对照方法进行大鼠体内血栓形成的测定。大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉,分离左颈外静脉和右颈总动脉,从颈总脉至颈外静脉插入一根带有丝线并充满肝素-生理盐水的聚乙烯套管,联接形成体外旁路循环。首先股静脉注射生理盐水3.13ml/kg,5 min后开放血流,血液从右颈总动脉流向右颈外静脉,15 min后中断血流,血液从左颈总动脉流向左颈外静脉,15 min后中断血流,迅速取出中间套管中丝线,放于滤纸上,而后称重,总重量减去丝线重量,即为给药前血栓湿重。再从股静脉注射当归补血汤注射液4.5 g/kg(3.13 ml/kg),更换带有丝线并充满肝素-生理盐水的中间套管,给药5min后开放血流,其他方法同上,所得血栓为给药后血栓湿重。当归注射液0.75g/kg(3.13ml/kg)、黄芪注射液3.75g/kg(3.13ml/kg)方法同上,计算血栓形成抑制率,比较各组抑制大鼠体内血栓形成的作用强度。结果见表12-16-28。

表12-16-28 当归补血汤注射液对大鼠体内血栓形成的影响(±s)

组别 动物数
(只) 剂量
(g/kg) 血栓重量(mg) 抑制率(%) 给药前 给药后 当归补血汤组
当归组
黄芪组 20
20
20 4.50
0.75
3.75 21.20±5.33
20.25±5.56
18.88±5.37 11.16±4.19
13.56±4.66
14.28±4.66 45.96±18.65**
33.85±18.51**
24.17±16.48**

注:给药前后比较:* * P<0.01
当归补血汤全方和拆方后当归、黄芪均有明显抑制体内血栓形成的作用,其作用强度是当归补血汤>当归>黄芪。当归补血汤的作用与当归、黄芪的作用比较,均有显著的差异,P<0.05和P<0.01;而当归与黄芪的作用比较则无明显的差异P>0.05。
6.对免疫功能的影响
6.1 对白细胞的活化作用^[29]
6.1.1当归补血汤含药血清对小鼠白细胞活化作用的时间一效应关系研究
含药血清的制备:小鼠随机分为8组,按体重灌胃给予当归补血汤水煎液0.1ml/10g体重,剂量为13.2g饮片/kg体重(相当于人临床用量的2倍),于给药后1、15、30、60、90、120、150、180min,分别乙醚吸入麻醉,于无菌条件下,行腹主动脉取血约0.8ml,置4℃冰箱中保存2h,以3000r/min于高速离心机中离心10min,取血清,置4℃冰箱中保存备用。正常对照血清的制备:根据体重,小鼠灌胃给予自来水0.1ml/10g体重,30min后,乙醚吸入麻醉,于无菌条件下,行腹主动脉取血约0.8ml,置4℃冰箱中保存2h,以3000r/min于高速离心机中离心10min,取血清,置4℃冰箱中保存备用。以上述制备的不同时相的当归补血汤含药血清进行当归补血汤含药血清对小鼠白细胞活化作用的测定,绘制其时间一效应曲线,并应用电子计算机模拟该时间—效应曲线。
当归补血汤灌胃后不同时相含药血清对小鼠白细胞的活化作用:结果见表12-16-29。与正常对照组比较,当归补血汤13.2g饮片/kg体重灌胃小鼠,其6～60min等不同时相的含药血清对小鼠白细胞均具有活化作用(P<0.01),而90～180min的含药血清对小鼠白细胞无明显活化作用(P>0.05)。

表12-16-29 当归补血汤不同时相含药血清对小鼠白细胞的活化作用(±s)

组别 n OD值 百分率(%) 正常对照血清组
6min血清组
15min血清组
30min血清组
60min血清组
90min血清组
120min血清组
150min血清组
180min血清组 8
4
4
4
4
4
4
4
4 0.0773±0.004
0.0870±0.001
0.0917±0.002
0.0863±0.003
0.0887±0.002
0.0813±0.001
0.0793±0.001
0.0803±0.001
0.0770±0.002 0.00
12.50**
18.53**
11.53**
14.66**
5.06
2.59
3.88
0.00

与正常对照组比较:* *P<0.01
6.1.2 当归补血汤含药血清对小鼠白细胞活化作用的剂量—效应关系研究
以6.6 g、19.8g、26.4g、33.0g饮片/kg体重(分别相当于人临床用量的1、3、4、5倍)分别灌胃小鼠,根据时间—效应曲线的达峰时间,在灌胃后15min,于无菌条件下行腹主动脉取血,制备血清,方法同前。测定不同剂量当归补血汤灌胃后的含药血清对小鼠白细胞的活化作用。
与正常对照血清组比较,当归补血汤6.6～33.0 g饮片/kg体重灌胃小鼠后15 min的含药血清,对小鼠白细胞分别具有活化作用(P<0.01)。结果见表12-16-30。

表12-16-30 当归补血汤含药血清对小鼠白细胞活化作用的量效关系(±s)

组别 n OD值 百分率(%) 正常对照血清组
6.6g/kg血清组
19.8g/kg血清组
26.4g/kg血清组
33.0g/kg血清组 8
4
4
4
4 0.0785±0.002
0.0858±0.003
0.0872±0.001
0.0920±0.003
0.1083±0.006 0.00
9.24**
11.15**
17.20**
37.90**

与正常对照组比较:**P<0.01
6.2 对正常小鼠免疫功能的影响:本药水煎剂和醇提剂均有增强小鼠腹腔巨噬细胞功能的作用,用药后其吞噬百分率及吞噬指数均明显高于对照组,作用可持续24h以上。预先给小鼠腹腔注射刺激剂(5%蛋白胨)以促进巨噬细胞的游出,再给与本药同样可得以上结果。拆方实验证明,黄芪增强巨噬细胞吞噬功能的作用较强,而当归作用则不明显^[30]
6.3 不同剂量黄芪配伍对免疫的影响[31]
吴敏毓等采用五种免疫指标,研究不同剂量黄芪在当归补血汤内的量-效关系,阐明当归补血汤古代方剂的辨证规律及剂量配伍的内在联系。黄芪与当归的配伍分别为2.5:1;5:1;10:1;20:1,按常规煮制,水浴浓缩,置冰箱备用。
小鼠随机分为5组盐水(NS)对照组,每鼠0.4ml/d;1/2剂量组(黄芪:当归=5:1)相当于生药0.29g/ml;常规剂量组(黄芪:当归=5:1)相当于生药0.5 g/ml;2倍剂量组(黄芪:当归=10:1)相当于生药0.92 g/ml;4倍剂量组(黄芪:当归=20:1)相当于生药1.75g/ml。各组均连续灌胃7 d,每天灌胃0.4 ml煎剂/只。
6.3.1 不同剂量黄芪配伍的当归补血汤对小鼠脾细胞NK活性的影响
表12-16-31结果说明,当归补血汤中黄芪剂量不同,对NK活性的影响也不相同。虽然与NS对照组相

表12-16-31 当归补血汤对小鼠脾细胞NK活性的影响(溶解率%,±s)

组别 鼠数
(只) 效靶细胞比 25:1 50:1 100:1 对 照
1/2剂量
常规剂量
2倍剂量
4倍剂量 9
9
10
9
9 9.70±3.77
19.81±3.98
33.12±4.00**
19.36±2.85
14.75±3.02 19.35±3.07
24.48±4.44
36.40±4.58**
26.35±3.07
23.22±3.54 12.44±3.90
21.19±3.87
34.10±4.58*
12.44±3.90
19.12±3.48

与对照组比较:* P<0.05,* * P<0.01比,NK活性均见升高,但唯有常规剂量组才能显著增加各浓度效:靶细胞比例中的的NK活性。同时可见在三种不同比例的效靶浓度中,以效:靶=50:1浓度的NK活性最强。
6.3.2不同剂量黄芪配伍的当归补血汤对小鼠脾细胞IL-2产生能力的影响
常规剂量组能明显促进小鼠脾细胞产生IL-2的能力,与NS对照组相比,其最高增长指数明显增高,差异显著(将两组最高增长指数不同稀释倍数的标本由t检验P<0.05)。此外,常规剂量组的最佳稀释度为1:8,而NS组为1:4,提示上清液中IL-2含量增加。而其他3组不同剂量黄芪配伍的当归补血汤对正常小鼠IL-2的产生能力无明显促进作用。
6.3.3不同剂量黄芪配伍的当归补血汤对小鼠下例溶菌酶等的影响
表12-16-32结果说明,不同剂量黄芪配伍的当归补血汤对小鼠溶菌酶含量、MФ活性和CIC含量的影响不全相同。常规剂量的溶菌酶含量及MФ活性显著升高,其它剂量组的上述两项指标与对照组相比差异无显著性。常规剂量组能使CIC含量下降,但随黄芪配伍量的加大,CIC含量增高,直至4倍剂量组与对照组相比差异有显著性。这一结果提示,常规用量的当归补血汤能提高小鼠非特异性免疫功能,且能清除CIC,但随黄芪剂量加大,当归补血汤亦可使CIC水平增高,在正常机体内CIC水平增高,则提示机体免疫功能趋于紊乱。

表12-16-32 当归补血汤对小鼠溶菌酶、CIC等免疫功能的影响(±s)

组别 鼠数(只) 溶菌酶含量(mg) M∅活性(OD值) CIC含量(OD值) 对照
1/2剂量
常规剂量
2倍剂量
4倍剂量 9
9
10
9
9 212±18.68
254±23.45
285±25.06*
255±27.06
201±41.73 0.204±0.031
0.244±0.018
0.344±0.029**
0.258±0.030
0.270±0.023 0.324±0.034
0.372±0.036
0.190±0.025**
0.417±0.035
0.489±0.066*

与对照组比较:* P<0.05,* * P<0.01
研究结果表明:当归补血汤内黄芪的剂量必须遵循“五倍黄芪归一份”的组方规律才能对机体发挥最佳免疫调整的作用,以维持机体的生理平衡现象。即黄芪:当归为5:1的常规配方组,其免疫增强作用最明显,表现为小鼠脾细胞NK活性对L929靶细胞的杀伤作用增强、IL-2的产生能力增强、溶菌酶含量和MФ活性也增高,同时CIC水平下降。一定剂量黄芪单味药能提高NK活性与增加由ConA引起小鼠脾细胞产生IL-2的能力。但黄芪在当归补血汤中的量效关系表现得更为突出,若增加黄芪剂量(如2倍、4倍剂量组)或减少黄芪剂量(1/2剂量组)均不能提高上述的前四项免疫指标,与盐水对照组相比虽有提高趋势,但无统计学意义。常规剂量组使小鼠血清中CIC水平下降,同样也随黄芪剂量的加大而使CIC水平上升直至与盐水对照组相比有显著差异。这些实验结果表明,中医对当归补血汤的配方原则是十分科学合理的,黄芪在本方内的剂量以及中医的各种方药应用规律和治则,自古沿用至今能经久不变的重要性是可信的。
6.4对脾细胞NK和IL-2活性的影响^[32]
昆明小鼠18～22g,随机分为5组。NS组:0.4ml NS/只·d,连续灌胃7d;半倍剂量组(黄芪:当归=2.5:1):0.4ml煎剂/只·d,连续灌胃7d;原剂量组(黄芪:归当=5:1);2倍剂量组(黄芪:当归=10:1);4倍剂量组(黄芪:当归=20:1)。
结果为当归补血汤对小鼠脾细胞NK活性影响:在效:靶=25:1,50:1,100:1的不同浓度中,唯有原剂量组能显著提高NK活性,其杀伤靶细胞活性分别为33.12%、36.04%、34.10%(与NS组相比P值依次为P<0.01,P<0.01,P<0.05)。而其它剂量组NK活性并未显著增高。当归补血汤对小鼠脾细胞IL-2产生能力的影响:仅原剂量组的当归补血汤能显著促进小鼠脾细胞产生IL-2的能力。具体表现为增长指数(GI)明显高于NS对照组(将两组最高GI不同稀释倍数的标本经数据处理后,由t检验得P<0.05)。其它剂量组对IL-2产生能力的影响与NS组相比,并未显示有促进作用。
陈玉春的研究也表明,当归补血汤也有显著促进血虚小鼠脾淋巴细胞产生白细胞介素-2(IL-2)的作用,(P<0.01)^[33]。
6.5 不同用药比例对小鼠红细胞膜流动性的影响^[34]
按常规煎药方法,制成1:1浓度的五种样品:黄芪、黄芪当归为5:1、黄芪当归为1:2、黄芪当归为1:1、黄芪益母草为1:1。
给药方法:每天上午8时灌胃10ml/kg,连续8d,对照组给蒸馏水。第9d摘除眼球取血,制备红细胞膜悬液。用荧光分光光度计测定红细胞膜荧光偏振度P值,计算其微粘度。结果见表12-16-33。

表12-16-33 当归补血汤不同用药比例时小鼠红细胞膜流动性的影响

组别 n P　 黄芪组
黄芪当归组(5:1)
黄芪当归(1:2)组
黄芪当归(1:1)组
黄芪益母草(1:1)组
对照组 9
9
9
10
10
9 0.2803
0.2792
0.2799
0.2651
0.2612
0.2807 3.2322±0.1453(0.2196)
2.9379±0.0970(0.1466)
3.1907±0.1602(0.2421)
2.7539±0.01608(0.1602)
2.6977±0.1565(0.2348)
3.2698±0.1904(0.2877)

()内为的对比限
P值与值反映的结果是一致的,即P越大,越大,膜流动性越弱。反之亦然。用对比限法对值作两两比较,用均数±对比限(±d)作图,根据两者是否重叠判断其差别是否有意义,结果黄芪与芪归1:1、黄芪与芪益母草1:1、对照组与芪归1:1、对照组与芪益母草1:1、芪归1:2与芪归1:1、芪归1:2与芪益母草1:1间对比限不重叠,与对照组相比,五方对小鼠红细胞膜流动性的作用强度依次为芪益母草1:1组>芪归1:1>5:1>1:2>黄芪组。
6.6 对小鼠MΦ受体及淋巴细胞PFC和ANAE的影响
LACA品系雄性健康小鼠,鼠龄3个月,体重22～25g,随机分为当补血汤全方(称全方)组,黄芪组、当归组及对照组。黄芪及当归,按传统药物比例黄芪比当归为5:1。每只小鼠每日给药量分别为:全方组0.6g/只,黄芪组0.5g/只,当归组0.1g/只,均为水煎剂(0.6ml/只),对照组给等体积水,口服灌胃,
6.6.1 当归补血汤及其单味药对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)受体的影响。
MΦ-EA-花环率(MΦ-FC受体的测定标志)的实验:结果见表12-16-34。

表12-16-34 当归补血汤对MΦ-EA-花环率的影响

组别 动物数 MΦ-EA-花环率(%)(±s) 增长率(%) P 对照组
当归补血汤组
黄芪组
当归组 8
8
8
8 28.6±2.65
46.25±2.89
46.8±5.06
32.9±2.38 61.7
63.6
15.0 <0.01
<0.01
>0.05

从表12-16-34说明当归补血汤和黄芪组,对MΦ-EA-花环率均有明显提高,并有显著差异。当归组的绝对数值虽然高于对照组,但差异无显著性。
MФ-YC-花环率(MФ-C3b受体的测定标志)的观察:见表12-16-35。

表12-16-35 当归补血汤对MФ-YC-花环率的影响

组别 动物数 MΦ-YC-花环率(%)(±s) 增长率(%) P 对照组 8 19.79±1.68　　 当归补血汤组
黄芪组
当归组 8
8
7 37.7±5.0
31.6±3.42
29.54±4.85 89.5
59.68
49.27 <0.01
<0.05
>0.05

从上表说明当归补血汤和黄芪组均可提高MФ-YC-花环率,并有显著性差异。当归组虽在绝对值上比对照组高,但无显著性差异。
6.6.2当归补血汤及其单味药对小鼠脾脏抗体分泌细胞(PFC)的影响

表12-16-36 当归补血汤对PFC的影响(±s)

组别 动物数 PFC数(106脾细胞数) 增长率(%) P 对照组 8 60.3±4.92　　 当归补血汤组
黄芪组
当归组 9
8
9 115.17±6.8
116.5±5.7
100.2±3.9 91
93.2
66.2 <0.01
<0.01
<0.01

上表中表明三个给药组对PFC的生成均有明显的促进作用。
6.6.3当归补血汤及其单味药对小鼠血中ANAE淋巴细胞阳性率的影响

表12-16-37 当归补血汤对ANAE阳性率的影响(±s)

组别 动物数 ANAE阳性率(%) 增长率(%) P 对照组 10 33.3±1.85　　 当归补血汤组
黄芪组
当归组 10
10
9 56.45±3.24
58.10±3.78
38.7±1.06 69.5
74.5
16.2 <0.001
<0.001
<0.05

结果可见三个给药组对ANAE均有显著的增长作用。
6.7对红细胞免疫功能的影响[36]
按传统方法水煎制成当归补血汤当归:黄芪1:5(100%)、当归汤(16.7%)、黄芪汤(83.3%),置于-20℃冰箱内备用。
6.7.1 对正常小鼠红细胞免疫功能的影响
取ICR小鼠,随机分为4组,实验组分别灌服当归汤、黄芪汤、当归补血汤各0.4ml/20g体重,对照组灌服相同体积生理盐水。连续7d。于末次给药后24h,进行红细胞C3b受体花环试验与红细胞CIC花环试验。结果见表12-16-38。当归补血汤能非常显著地提高红细胞C3b受体花环率和降低红细胞CIC花环率,与当归汤组及黄芪组比较,差别亦非常明显。

表12-16-38 当归补血汤对正常小鼠红细胞免疫功能的影响(±s)

组别 鼠数 C3b受体花环率(%) CIC花环率(%) 生理盐水
当归汤
黄芪汤
当归补血汤 10
9
10
10 19.24±0.96
21.11±1.43*
20.94±1.59*
24.96±1.02**△△ 10.66±0.86
8.96±1.01**
8.78±1.01**
7.53±0.87**△△

与生理盐水组比较:*P<0.05,**P<0.01;与当归汤组和黄芪汤组比较:△△P<0.01
6.7.2 对免疫低下小鼠红细胞免疫功能的影响
取ICR小鼠,随机分成4组,于实验的第1、3、5d分别腹腔注射强的松龙25mg/kg。其中3组实验第1d起分别灌服当归汤、黄芪汤、当归补血汤各0.4ml/20 g体重,另1组灌服相同体积生理盐水,连续7 d。于末次给药后24 h,进行红细胞C3b受体花环试验与红细胞CIC花环试验。如表12-16-39所示,当归汤、黄芪汤、当归补血汤均能对抗强的松龙的免疫抑制作用,当归补血汤全方与当归汤、黄芪汤相比,作用更为显著(P<0.01)。

表12-16-39 当归补血汤对免疫低下型小鼠红细胞免疫功能的影响(±s)

组别 鼠数 C3b受体花环率(%) CIC花环率(%) 强的松龙
强+当归
强+黄芪
强+全方 10
10
10
10 11.71±0.76
14.08±0.62***
14.00±0.79***
17.91±1.27**△△ 15.97±1.01
13.11±1.09**
14.25±1.00**
11.10±1.28**△△

6.8 对癌证动物及患者免疫功能的影响
当归补血汤(当归15 g,生黄芪30 g)水煎服,每日1剂,15 d为1疗程,治疗21例癌症患者,并用酯酶染色方法,观察患者服药前后白细胞总数、T淋巴细胞百分数及酯酶活性的变化。结果表明:本方使21例癌症患者的白细胞明显升高(P<0.05);虽用药后淋巴细胞的百分率变化无明显差异,但Ⅱ级T淋巴细胞,即酯酶含量高的T淋巴细胞明显增加(P<0.05)。提示本方能增强T淋巴细胞的酯酶活性,有利于调动患者自身抵抗肿瘤的免疫力。另观察本方对患者B淋巴细胞百分数无显著影响^[37]
张氏等用小鼠肿瘤模型(S180、H22)观察了复方归芪口服液与顺铂、丝裂霉素、阿霉素合用的增效作用及对毒性的影响。结果:复方归芪口服液对2种瘤株均有一定的抑制作用,并与其他3种化疗药分别合用时,对荷瘤小鼠有明显的化疗增效作用。可明显拮抗引起白细胞、淋巴细胞、红细胞减少,提高免疫功能,对阿霉素的心脏毒性也有解毒作用^[38]。
刁氏等实验发现当归补血汤能明显抑制小鼠肝癌Hca-F25/16A3淋巴结移率和淋巴结转移程度,其作用机制是通过抑制脾细胞调亡,增加淋巴细胞免疫活性来实现的^[39]。
本药对玫瑰花形成细胞(RFC)数无明显影响,而本药加味(黄芪、当归、女贞子、补骨脂、焦山楂)则对RFC有明显促进作用。另外当归补血汤还能明显提高溶血素血清抗体的效价^[40]。ICR小鼠随机分为4组,各组分别灌服当归、黄芪、当归补血汤各0.4 ml/20 g。连续17 d,测各组红细胞C3受体以及CIC受体(花环试验)。结果:当归补血汤能非常显著地提高红细胞C3受体花环率和降低红细胞CIC花环率(P<0.01或P<0.001)^[41]。
用加味当归补血汤(本方加枸杞子、甘草等中药组成)口饲给药,观察对用L3T4(抗CD4)McAb建立的实验性TH细胞(T辅助细胞)缺陷小鼠的免疫功能影响。结果表明,加味当归补血汤能够明显改善其免疫功能。表现为:脾细胞对ConA、LPS的反应性及自然增殖率明显高于未治疗免疫缺陷组(ID),P<0.01;igG、IgE抗体应答及DTH都显著高于免疫缺陷模型组;ConA活化的脾细胞对外源性IL-2的反应性大于免疫缺陷模型组,接近正常对照小鼠^[41]。
加味当归补血汤对60Co一次性全身照射小鼠的免疫功能有不同程度的保护作用和促进恢复作用。该方药明显提高辐射小鼠脾抗体形成细胞释放溶血素量、血清溶血素效价、血清溶菌酶含量及ANAE阳性淋巴细胞比率,但鼠脚垫迟发超敏反应的作用不明显^[41]。拆方研究表明,当归补血汤及其加味药对辐射(60Co一次全身照射)小鼠脾脏抗体形成细胞释放溶血量、血清溶菌酶量、ANAE阳性淋巴细胞比率、脚垫迟发超敏反应及RBC-G3b受体花环率均有不同程度的明显促进和提高作用;RBC-IC(红细胞-免疫复合物)花环形成率除当归外都有明显的增强作用^[43]
阴氏等^[44]应用血清药理学研究方法,观察了当归补血汤对小鼠巨噬细胞的的活化作用。时效关系研究表明,13.2g饮片/kg体重给小鼠灌胃后6～60min等不同时相的含药血清对小鼠巨噬细胞均具有活化作用,量效关系研究表明:13.2～33.0饮片/kg体重,分别灌胃小鼠后的含药血清对小鼠巨噬细胞均具有活化作用。
包氏等采用2种造模方法:即大剂量短程、小剂量长程的方法,结果前法小鼠死亡率高为43.2%,而后法为19.6%,实验表明当归补血汤能改善骨髓抑制状况,明显提高白细胞数,改善和增强免疫功能,具有改善化疗药物的致毒作用^[45]。
王氏等通过脾虚动物模型灌服当归补血汤,经检测小鼠的脾重量、脾重指数,脾脏及外周血白细胞计数、胸腺重量及指数、腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数、绵羊红细胞定量溶血等项目,结果显示用药后小鼠的特异性和非特性免疫功能有明显的改善^[46]。
另有关于当归补血汤加味对老年小鼠或烧伤大鼠免疫功能的实验研究^[47～49]。
7.对缺氧的影响
7.1 小鼠常压耐缺氧实验^[50]
选用18～22g雄性小鼠按体重配对后随机分为给药组及对照组,给药组小鼠按0.3ml/10g剂量,每天灌胃给药1次,对照组给予生理盐水,灌胃6d,末次给药1h后,进行耐缺氧实验,观察动物存活时间,并用测氧仪测定各小鼠死亡时容器中残余氧的含量,结果见表12-16-40。

表12-16-40 当归补血汤对小鼠常压耐缺氧能力的影响(±s)

组别 动物数(只) 存活时间(min) 残余氧浓度(mmHg) 对照组
当归补血汤组 12
12 13.8±1.26
15.7±1.34** 4.9±0.6
4.4±0.29*

与对照组比较:* p<0.05,* * P<0.01
实验结果表明,当归补血汤能显著延长小鼠的存活时间,降低动物死亡时容器中残余氧量。
7.2大量窒息缺氧实验^[50]
选用180～240g雄性大鼠,按体重配对后随机分为给药组与生理盐水对照组,给药按3ml/100g剂量每天灌胃1次,共4d,末次给药1h后进行实验。参照Rsoner的方法,大鼠用盐酸氯胺酮130mg/kg腹腔注射麻醉后,在头矢状缝左侧1.5mm处的顶骨上安装两个电极,引导皮层脑电。气管切开插管,腹腔注射氯化筒箭毒(0.6mg/只)后,即接人工呼吸机进行人工呼吸。股动脉插管,通过血压换能器(MPμ-0.5A)记录股动脉压,将血压、脑电和肢体Ⅱ导联心电输入多道生理记录仪同步描记,末次给药1h后,关闭人工呼吸机造成动物窒息,记录心电、脑电和血压变化,80s后恢复人工呼吸,以心电T波高耸的最高点和脑电振幅低于20μV作为心与脑功能衰竭的指标,以恢复人工呼吸后脑电棘丛波出现的时间作为功能开始恢复的标志。结果见表12-16-41。

表12-16-41当归补血汤对窒息大鼠心电、脑电的影响(x±s)

组别 动数(只) 心电T波达最高点时间(s) 脑电消失时间(s) 脑电恢复时间(s) 对照组
当归补血汤组 7
7 23.3±4.3**
36.4±5.9 41.5±4.9
53±8.9 36.9±9.8**
22.6±8

与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01
从表12-16-41可见,当归补血汤能显著延缓窒息大鼠心电T波高耸和脑电消失的时间,促进恢复供氧后脑电活动较快的出现。
7.3对缺氧小鼠血液和心、脑组织乳酸含量的影响^[50]
血液乳酸含量:小鼠分为给药组、生理盐水组及正常(不缺氧)对照3组。动物条件和给药剂量同上实验,用500ml玻璃干燥器作缺氧装置,每次放入给药组及生理盐水组小鼠各1只,钠石灰10g,用测氧仪测定容器中的含氧量,当测得含氧量降至6%时,迅速同时取出小鼠,剪断左颈部血管放血,滴入放有氟化钠一草酸钾的试管中,立即混合,按Barker-Summerson方法,用分光光度计测乳酸含量,正常对照组小鼠不经缺氧即放血作测定,结果见表12-16-42。

表12-16-42 当归补血汤对严重缺氧小鼠血乳酸含量的影响(x±s)

组别 动物数(只) 血乳酸含量(mg/100ml) P值 正常对照组
生理盐水组 11
11 14.8±3.1
44.3±16.6　 当归补血汤组 11 36.7±15 <0.05

如表12-16-42所示,给药组小鼠缺氧后血液乳酸含量增高的程度显著低于盐水对照组。
心、脑组织乳酸含量:动物分组,给药及缺氧等条件同上,当测得容器中残余氧含量降至6%,迅速将小鼠投入液氮中冷冻,正常对照组动物不经缺氧即投入液氮中,冷冻后取出,剖取心脏和大脑,用万分之一天平立即称取一定量的心肌和大脑组织,分别放人4倍体积预冷的15%三氯醋酸中进行匀浆,沉淀蛋白及中止酶活性,参照Barker-Summerson方法略加改进,测定乳酸含量,结果见表12-16-43。

表12-16-43 当归补血汤对严重缺氧小鼠心、脑乳酸含量的影响(x±s)

组别 动物数(只) 心肌乳酸(mg/100g) 大脑乳酸(mg/100g) 正常对照组
生理盐水组
当归补血汤组 9
8
9 57.8±13.3
81.2±20
65.2±9 35.5±8.6
61.1±7.7
51.6±6.4*

与生理盐水组比较:*P<0.05
如表12-16-43所示,当归补血汤能显著减低严重缺氧小鼠心、脑组织乳酸含量升高的程度。
7.4对大鼠梗死心肌耗氧量的影响^[50]
用180～240g雄性大鼠24只,分给药组(10只)、生理盐水组(10只)及假手术组(4只),给药组大鼠按3ml/100g剂量每天灌胃1次,生理盐水组灌同体积生理盐水,共4d,最后1次灌胃1h后,大鼠在乙醚浅麻醉下,于胸骨左沿纵向切口,剪断第2～4肋骨,打开胸腔,挤出心脏,在距左冠状动脉起点2～3mm处用0000号丝线结扎左冠脉主干,假手术组只穿线但不予结扎,随即把心脏送回,挤出胸腔的空气,关闭胸壁后,动物即开始自主呼吸(个别是辅以工人呼吸)。用502粘合剂粘合创口。30min后,击头处死动物,取出心脏,放在冰浴盘上纵向切取梗死区心室肌两薄片,湿重约为40mg,测氧仪测定台氏液37℃、30min孵育心肌前后的氧分压,其差值即为心肌耗氧量,结果见表12-16-44。

表12-16-44 当归补血汤对急性梗死心肌耗氧量的影响

组别 动物数(只) 心肌耗氧量(mmHg) P值 正常对照组
生理盐水组 4
10 63.8±17
83.5±25　 给药组 10 65.5±25.6 <0.05

从表12-16-44可见,与生理盐水组相比,当归补血汤能显著降低缺血心肌的耗氧量。
宋氏用本方10g/kg灌胃,可显著延长小鼠常压下缺氧后的生存时间。10～20g/kg可显著延长小鼠断头后呼吸动作的持续时间^[25]。
冯氏等观察了当归补血汤加味(当归、黄芪、丹参、川芎、桃仁、银杏叶)对脑缺血的作用,显示该方能减轻脑缺血后的病理损伤,明显改善脑血液循环,促进脑生理功能的恢复^[51]。
8.抗自由基损伤作用
用本方浓缩液1.44g/ml、黄芪液0.24g/ml和当归液1.20g/ml分别体外给药,观察到各组对温浴和Fe2+诱导条件下的小鼠肝匀浆的LPO生成均有明显的抑制作用;用以上三种药液和维生素E同等剂量分别灌胃给药,其高、低剂量均能明显降低小鼠肝组织LPO含量,且当归补血汤的作用与当归液、黄芪液、维生素E的作用无显著性差异。提示本方可能通过抗氧化作用减少LPO的生成及其对组织细胞的损害而发挥较广泛的药理作用^[52]。对按不同比例配伍的当归补血汤(1:1、5:1、1:2)灌胃处理后的小鼠红细胞的荧光偏振度测定表明,当归补血汤可以增强红细胞膜流动性,但作用不显著。
阴氏等量效关系研究表明,当归补血汤含药血清抗自由基作用呈现一定的量效关系,通过时效关系研究,测定了当归补血汤含药血清抗自由基的有关药效动力学参数^[53]。
阴氏等运用药效动力学研究方法观察了灭活对当归补血汤含药血清抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成作用的影响。结果表明,灭活后当归补血汤含药血清的Ke、ty₂(Ke)、td、tp、等药效动力学参数均较灭活前为低,而xmin、ka、t1/2(Ka)等药效动力学参数均较灭活前为高。说明灭活可降低当归补血汤含药血清对小鼠肝组织过氧化脂质生成的抑制作用,但其降低作用并不明显,对实验结果无明显影响^[54]。
9.对肝脏功能的影响
9.1 对体外培养肝细胞(5-H3)尿嘧啶核苷掺入的影响[55]
用显微放射自显片显示RNA的合成,除细胞分裂期(M期)外,在整个细胞周期(G1,S,G2期),均可进行RNA的合成。但核仁RNA的合成在G1期较低,在S期最旺盛,直至G2期仍保持恒定的高水平,待染色体明显浓缩时,RNA的合成完全停止。这一规律在动植物细胞、培养细胞和肿瘤细胞均如此。
在体外培养肝细胞内加当归补血汤以后,(5-H3)尿嘧啶核苷掺人增强,提高了核仁RNA在G1期的合成率。由此可知加当归补血汤后肝细胞分泌到培养基中蛋白质的量亦随之而增加。此外,加当归补血汤以后细胞增生活跃,细胞体积增大,RNA合成率高,而对照组(5-H3)尿嘧啶核苷掺入率很低,仅1.92%,而加当归补血汤组为5.2%,有统计意义,促进RNA和蛋白质合成,这对恢复肝功能有临床意义。
9.2对小鼠四氯化碳所致肝损害的保护作用。
实验前保肝组每天灌服不同剂量的本方煎剂(Ⅰ组10g/kg;Ⅱ组25g/kg;Ⅲ组50g/kg),2次/d,每次0.8ml/只,连续3d。对照组用同体积生理盐水。第5d,均在右腹皮下注射醋酸强的松50mg/kg(0.2 ml),灌服10%四氯化碳(CCL4)油乳(20 ml/kg)造成小鼠急性肝损害,于造模用药后16 h(肝损害高峰期)时,摘眼球采血查SALT,并光镜下观察肝组织形态学,计算肝损害面积。结果表明:保肝组小鼠的SALT均比对照实验组明显降低(P<0.01),形态学检查:肉眼观察:对照组,肝脏增大呈暗灰色,甚则呈灰黄红色,或见黄褐色斑块,包膜较紧张,光滑,质较软,部分肝脏切面呈槟榔状。Ⅰ、Ⅱ组,肝脏轻度增大,包膜较紧张表面呈暗红褐色或微黄,部分肝脏出现黄褐色斑点状,质稍软。Ⅲ组的肝损害病变最轻。光镜检查:对照组肝组织内出现多个大小不等的坏死灶,其最大坏死灶为55μm,最小坏死灶为28μm,大多数坏死以中央静脉为中心且呈片状,肝细胞崩溃,细胞核固缩,碎裂,液化,肝索紊乱不清,肝窦扩张瘀血,而肝小叶周边肝细胞基本正常,少数区域出现整个肝小叶坏死,有的甚至出现桥连性坏死,部分肝细胞出现广泛性颗粒样变,气球样变及脂肪样变。Ⅰ组病变较四氯化碳组为轻,可见肝细胞点状坏死或气球样变,肝小叶部分存在,部分坏死,最大坏死灶为40μm,最小坏死灶为20μm。另外间质内可见淋巴细胞和单核细胞浸润。Ⅱ组的肝组织内可见点状坏死灶,其最大最小坏死灶分别为28μm和12μm。肝细胞呈颗粒样变性和气球变性,间质内有淋巴细胞和单核细胞浸润。Ⅲ组的肝组织坏死明显减少,其最大、最小坏死灶分别为22μm和9μm,坏死肝细胞相间,也可见颗粒、气球或脂肪样变性。在汇管区可见灶性淋巴细胞和单核细胞浸润。以上结果提示,当归补血汤对四氯化碳所致小鼠肝损害有明显保护作用。实验中的当归补血汤剂保肝效应呈良好的剂量关系。^[56]
9.3对氢化可的松所致肝损伤的保护作用^[57]
实验分为3组,正常组、氢可组:每日肌注氢化可的松5mg/100g体重,共6 d;“气血”十氢可组:与氢可组处理相同,同时在注射氢化可的松前两天开始,每日灌服“气血注射液”(人参、黄芪、当归)1 ml/100 g体重,共8 d;于实验第9 d取材,常规制成电镜样品。结果表明,氢可组肝细胞核膜凹陷、皱折;线粒体数减少、肿胀,基质电子密度降低,中心部出现相对无崤的“中空区”,每个线粒体截面内所含基质颗粒数由3.78减少为1.91,粗面内质网减少,脱颗粒,游离的多聚核蛋白体相对增多;糖原及脂滴亦增多。电镜负染色,可见线粒体内膜内表面的内膜基粒柄部拉长变窄,球状头部突出。加用中药后,上述变化减轻,并可见核仁增大,“边集现象”增多,线粒体数量增加,基质颗粒是氢可组的2.4倍,杯形、分枝形、环形等多形性线粒体比例增加,是氢可组的1.5倍。以上变化以肝小叶周围带最明显。粗面内质网平行密集排列,糖原略有增加,未见脂滴。内膜基粒恢复到正常:球形头部清晰、柄部缩短、紧贴内膜。
实验结果表明氢化可的松对蛋白质合成及能量代谢有抑制作用、“气血注射液”对氢化可的松所致肝损伤有一定保护作用。
9.4对肝组织过氧化脂质的影响^[58]
9.4.1 当归补血汤原药液体外抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成的作用
小鼠断头放血,迅速取出肝脏,以4℃生理盐水洗去表面残血,制成10%肝匀浆。各试管中加入1.5 ml肝匀浆、0.1 ml当归补血汤原药液或生理盐水,测定每克肝组织中丙二醛(MDA)的生成量,计算当归补血汤原药液体外对小鼠肝组织过氧化脂质生成的抑制率。原药液体外对当归补血汤抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成作用的非药物活性因素分析:各试管中加入生理盐水1.5ml,分别加入不同浓度的当归补血汤原药液或生理盐水0.1ml,于37℃恒温水浴箱中温浴1.5h,置冰水中冷却10min,加入20%三氯醋酸(TAC)1.5ml,充分混匀,静置10min后,以3000r/min离心10min,取上清液1.5ml,加0.67%硫代巴比妥酸钠(TBA)1.0ml,95℃水浴10min,取出后置冷水中冷却10min,于分光光度计532nm测定吸收度。
结果为当归补血汤水煎液体外对小鼠肝组织过氧化脂质生成未见抑制作用,反而表现出一定的“促进”生成的作用,并呈一定的“量效关系”。结果见表12-16-45。当归补血汤随着原药液浓度的增加,其OD值呈增加的趋势,并呈一定的“量效关系”。这主要是由于当归补血汤原药液随着浓度的增加,其自身色泽也逐渐加深,因而,在比色反应中,呈现出随着原药液浓度的增加,其OD值呈增加的趋势。结果见表12-16-46。
9.4.2当归补血汤含药血清体外抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成的作用

表12-16-45 当归补血汤水煎液体外抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成作用(±s)

组别 n MDA(nmol/g) 抑制率(%) 生理盐水组
0.66g/ml组
1.32g/ml组
2.64g/ml组 6
6
6
6 4.21±1.61
5.95±0.16*
8.31±0.39**
14.15±2.30** 0

与生理盐水组比较:* P<0.05,* * P<0.01
血清的制备:含药血清的制备:健康小鼠,随机分为5组,每组10只,雌雄各半,按体重灌胃给予当归补血汤水煎液0.1ml/10g体重,剂量分别为6.6g、13.2g、26.4g、52.8g、66g饮片/kg体重(按人和动物体表面积折算,相当于人临床用药剂量的1、2、4、8、10倍),制备含药血清。

表12-16-46 不同浓度当归补血汤原药液的OD值(±s)

组别 n OD值 生理盐水组
0.66g/ml组
1.32g/ml组
2.64g/ml组
5.28g/ml组 6
4
4
4
4 0.0024±0.0039
0.0723±0.0050**
0.1295±0.0105**
0.2420±0.0569**
0.4525±0.0144**

与生理盐水组比较:* * P<0.01
空白血清的制备:健康小鼠15只,根据体重灌胃给予自来水0.1ml/10g体重,60min后,制备空白血清。小鼠断头放血,迅速取出肝脏,以4℃生理盐水洗去表面残血,以生理盐水制成10%肝匀浆。各试管中加人肝匀浆1.5ml,加入0.1ml当归补血汤含药血清或空白血清,测定每克肝组织中丙二醛(MDA)的生成量,计算当归补血汤含药血清对小鼠肝组织过氧化脂质生成的抑制率。含药血清体外对当归补血汤抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成作用的非药物活性因素分析:各试管中加入生理盐水1.5ml,分别加入不同浓度的当归补血汤含药血清或空白血清0.1ml,于37℃恒温水浴箱中温浴1.5h,置冰水中冷却10min。其余处置过程同前。于分光光度计的532nm波长下测定吸收度。
结果:当归补血汤含药血清体外对小鼠肝组织过氧化脂质生成表现显著的抑制作用,并呈现量效关系。结果见表12-16-47。当归补血汤不同剂量的含药血清,其OD值未见变化。表明当归补血汤含药血清不存在色泽对实验结果的影响,结果见表12-16-48。

表12-16-47 当归补血汤含药血清体外抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成的作用(±s)

组别 n MDA(nmol/g) 抑制率(%) 空白对照血清组
6.6g/ml血清组
13.2g/ml血清组
26.4g/ml血清组
52.8g/ml血清组
66.0g/ml血清组 15
10
10
9
10
10 57.95±5.93
51.96±6.12*
50.69±11.36*
50.48±7.14**
49.79±6.61**
48.70±6.98** 0
10.35
12.54
12.90
14.09
15.06

与空白对照组比较:* P<0.05,* * P<0.01

表12-16-48 不同剂量的当归补血汤含药血清的OD值(±s)

组别 n OD值 生理盐水组
空白对照血清组
6.6g/ml血清组
26.4g/ml血清组
52.8g/ml血清组 6
4
4
4
4 0.0024±0.0039
0.0023±0.0021
0.0023±0.0021
0.0025±0.0035
0.0023±0.0020

9.4.3 当归补血汤灌胃给药对小鼠肝组织过氧化脂质生成的抑制作用
同前法给药,每只小鼠于腹主动脉取血后,迅速取出肝脏,4℃生理盐水洗去表面残血,以生理盐水制成10%肝匀浆,各试管中加入肝匀浆1.5ml,于37℃恒温浴箱中恒温震荡反应1.5h,置冰水中冷却10min,中止反应。其余处置过程同9.4.1。计算当归补血汤灌胃给药对小鼠肝组织过氧化脂质生成的抑制率。
与空白对照组比较,不同剂量的当归补血汤灌胃给药对小鼠肝组织过氧化脂质生成具有一定的抑制的作用,并呈一定的量效关系。结果见表12-16-49。

表12-16-49 当归补血汤灌胃给药抑制小鼠肝组织过氧化脂质生成的作用(±s)

组别 n MDA(nmol/g) 抑制率(%) 空白对照组
6.6g/kg组
13.2g/kg组
26.4g/kg组
52.8g/kg组
66.0g/kg组 15
10
10
10
9
10 57.84±17.35
51.53±7.61
50.23±13.23
48.70±3.47
43.61±8.09*
43.18±14.78* 0
10.91
15.08
15.81
18.94
22.95

与空白对照组比较:*P<0.05
10.对肾小球硬化模型的影响^[59]
用嘌呤霉素100mg/kg体重给予大鼠腹腔注射,其后每隔2周给25mg/kg体重共5次,正常组腹腔注射等量生理盐水。选取首次给药后2周尿蛋白>150mg/24 h尿,随机分模型组(7只)、中药组(6只)和西药组(7),组间尿蛋白定量无统计学意义。自首次注射嘌呤霉素后2周,各组均经灌胃给药。中药组每天灌黄芪当归合剂(简称中药)3 ml,西药组每天给普伐他汀(简称西药)6mg/kg体重,正常组和模型组每天给自来水3 ml,疗程为10周。实验期肾病各组均予富蛋白饮食(蛋白质含量38.3%,其中酪蛋白14.3%)。实验全过程为12周。尿蛋白及血清生化指标测定:血清脂谱:总胆固醇(Tch)、三酰甘油(TG)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A1(apoA1)、载脂蛋白B100(apoB100),于实验第7周和12周各取血1次,酶法操作。血清总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),于实验第12周取血,采用Beck-man自动生化分析仪检测。尿蛋白定量,每周检测1次。
肾脏病理学观察:于第12周实验结束处死大鼠,肾标本以10%甲醛固定,石蜡包埋。切片厚2μm,PAS染色,每份标本光镜下双盲观察60个肾小球,用记分法计算肾小球硬化指数(GSI)。(2)免疫组织化学(SP)法,切片厚4μm,检测胶原Ⅲ、Ⅳ型(第一抗体为兔抗人Ⅲ或Ⅳ型胶原抗体,采用纤维连接蛋白(FN,第一抗体为兔抗人FN抗体),层粘连蛋白(LN,第一抗体为兔抗人LN抗体),计算机MPIAS-400多媒体彩色病理图像分析系统,对免疫组织化学结果进行半定量分析,每份标本测10个肾小球,用面积计算诸基质成分在肾小球中相对含量,以均值作比较。
对尿蛋白的影响:模型组大鼠首次给嘌呤毒素1周尿蛋白阳性,2周尿蛋白均超过150mg/24h尿,且呈逐渐增加,于实验第7～8周时,模型、西药和中药各组尿蛋白较治疗前分别增加104%、101%和101%;至实验结束前,上述各组尿蛋白较第7～8周时分别增加11%、19%、37%,而较用药前分别增加128%、138%和175%。
对血清脂谱、蛋白、肾功能的影响:大鼠脂谱与人类不完全相同,主要区别是大鼠HDL含胆固醇比例较高。中药和西药两组Tch、TG、VLDL、HDL及中药组LDL、apoA1和apoB100均明显低于模型组(P<0.05),见表12-16-50。于实验第12周时中药组血浆白蛋白明显高于模型组和西药组,与正常组比较无差异。中药组和西药组Scr和BUN明显低于模型组,中药组尤为显著,见表12-16-51。

表12-16-50 黄芪当归合剂等4组大鼠血清脂谱测定结果比较(±s)

组别 n Tch TG LDL VLDL HDL apoA1 apoB100 (mmol/L) (g/L) 正常
模型7周
12周
西药7周
12周
中药7周
12周 3
7
7
6
6
6
5 1.69±0.37
7.74±2.62**
8.23±0.98**
5.47±1.39**△
7.39±2.39**
2.62±1.47**△△
3.83±1.64**△△ 0.97±0.32
7.81±1.65**
5.31±1.96**
4.45±1.16**△
2.79±1.89**
3.42±2.33**△△
2.27±2.06△ 0.86±0.31
3.94±2.53**
4.64±1.37**
2.93±1.35**
4.65±2.43**
1.18±0.69△△
2.31±0.87**△ 0.19±0.06
1.56±0.33**
1.06±0.39**
0.89±0.23**△
0.56±0.38**
0.69±0.47**△△
0.46±0.41 0.64±0.14
2.23±0.39**
2.53±0.46**
1.65±0.19**△
1.94±0.54**
1.76±0.49**△
1.08±0.50**△ 0.80±0.10
0.93±0.21*
1.32±0.27**
0.92±0.19*
1.06±0.13**
0.95±0.13*
0.80±0.31△ 0.27±0.02
0.53±0.25**
0.57±0.03**
0.44±0.23*
0.58±0.13**
0.54±0.05**
0.31±0.08△△

肾小球系与正常组比较:* P<0.05,* * P<0.01;与模型组同期比较,△P<0.05,△△P<0.01
肾脏病理观察:光镜:模型组多数膜细胞重度增生,细胞外基质(ECM)增多,球囊粘连,局灶节段硬化;肾小管多灶状萎缩和代偿性肥大,多数管腔内有蛋白管型,肾间质多灶状单个核细胞浸润。西药组部分肾小球系膜细胞轻～中度增生和基质增多,球囊粘连、少数小球出现节段硬化;部分肾小管腔内有蛋白管型;肾间质偶见小灶状单个核细胞浸润。中药组少数肾小球系膜细胞增生和基质增多,偶见球囊粘连和节段硬化;偶见肾小管腔内蛋白管型;肾间质未见异常。两治疗组肾小球硬化指数(GSI)显著低于模型组,见表12-16-51。

表12-16-51 4组大鼠血浆蛋白和肾功能(实验第12周)测定结果比较(±s)

组别 鼠数 TP Alb Scr
(μmol/L) BUN
(mmol/L) (g/L) 正常
模型
西药
中药 8
5
7
6 66.07±3.23
66.62±5.46
62.34±6.95
68.73±4.01 34.20±0.70
28.19±2.56*
25.61±4.53*
33.98±4.47△▲ 27.49±16.45
107.06±71.43**
75.97±33.06**△
26.23±9.19△△▲ 5.35±0.94
27.39±22.35**
12.86±6.29**△
9.61±1.86*△

与正常组比较,* P<0.05,* * P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与西药组比较,▲P<0.05
免疫组织化学:胶原Ⅳ型(ColⅣ)、LN主要位于正常肾小球的基底膜、肾小囊基底膜和肾小管基底膜,FN主要位于系膜区,胶原Ⅲ型(ColⅢ)在正常肾小球内几乎没有分布。病变小球系膜区和球囊粘连部不仅胶原Ⅳ型,LN、FN明显聚积、而且也可见胶原Ⅲ型聚积,严重硬化的小球尤为明显,间质区亦有聚积,计算机图像半定量分析显示两治疗组ECM明显少于模型组,见表12-16-52。

表12-16-52 3组大鼠肾小球硬化指数和细胞外基质比较(±s)

组别 鼠数 GSI ECM LN FN ColⅣ colⅢ 模型
西药
中药 7
7
6 120.26±61.87
30.60±19.51**
5.15±4.97**△ 69.65±17.45
26.03±5.05**
16.07±6.09**△ 70.53±13.48
32.36±12.44**
17.36±2.22**△△ 76.77±12.44
29.21±9.83**
15.5±12.75**△△ 85.90±11.52
29.52±12.37**
10.44±5.74**△△

与模型组比较:* P<0.01;与西药组比较:△P<0.05,△△P<0.01;表内数据为面积比
11.黄芪当归汤及其不同配伍对血浆铁铜元素含量的影响[61]
11.1 黄芪、当归及其不同配伍煎液中铁、铜元素含量测定
原药材先后用自来水、蒸馏水和超纯水冲洗净化,70～80℃烘干。取少量原药碾细,分别准确称取黄芪、当归粉0.3 g,以硝酸-高氯酸(5:1)作湿法消化,在热板上挥干消化液,残渣以超纯水溶解稀释至25ml待测。分别称取黄芪、当归各30 g,并以该两药不同比例(5:1、4:2、3:3、2:4、1:5)的配伍各称取30 g,水煎两次合并滤液,各取1/10溶液(相当于含生药3 g),加入浓硝酸过夜,于热板上以硝酸-高氯酸消化,以超纯水稀释定容至25 ml,各样本制3个复管,同时以超纯水作空白对照管。
于原子吸收分光光度计测定各样本的Fe、Cu含量,测定条件见表12-16-53。

表12-16-53 测定条件(火焰法)

元素 灯电流(mA) 波长(nm) 狭缝(nm) C2H2流压(kg/cm2) 焰高(mm) Fe
Cu 15.0
7.5 248.3
324.8 0.2
1.3 0.3
0.3 7.5
7.5

表12-16-54 黄芪、当归及其不同配伍煎液中Fe、Cu元素含量的测定

样 品 Fe含量(μg/g) 煎出率(%) Cu含量(μg/g) 煎出率(%) 当归生药 245.80　 10.80　 当归煎液
黄芪生药 19.00
174.20 7.73 0.81
7.75 7.50 黄芪煎液
芪归5:1煎液
芪归4:2煎液
芪归3:3煎液
芪归2:4煎液
芪归1:5煎液 27.90
12.75
12.00
14.75
22.10
39.10 16.02
6.85
6.05
7.02
9.96
16.72 0.58
0.56
0.69
0.61
0.73
1.19 7.48
6.78
7.87
6.58
7.41
11.56

结果表明,单味当归的铁、铜元素含量均高于黄芪,但煎出率不一定高。单味黄芪的铁元素煎出率明显高于当归,并在配伍中明显增加煎出率,其煎出率大小呈现对铁元素含量较高的当归在配伍中的比例大小的依赖关系(见表12-16-54)。
11.2对正常小鼠血浆中铁、铜元素含量的影响
小鼠60只,雌雄各半,体重18～22g,随机分成6组,分别灌胃给予黄芪、当归及芪归5:1、3:3、1:5之煎液,剂量均为20g/kg,对照组灌胃等容量生理盐水。连续给药11d,第11d给药后1h,摘眼球采血0.5ml(其中含0.05ml肝素生理盐水抗凝液),4000r/min离心5min,吸取上清液(血浆)100μl以超纯水稀释至1ml待测。结果表明黄芪、当归及等量配伍给药组的铁含量明显高于对照组,给药组的铜含量除1:5组外,也明显高于对照组,说明黄芪、当归及其配伍应用可增高正常小鼠血浆中铁、铜元素的含量,见表12-16-55。

表12-16-55 黄芪、当归及其配伍应用对正常小鼠血浆中Fe、Cu元素含量的影响(ppm)

组别 Fe Cu 组别 Fe Cu 生理盐水
黄芪
当归 0.38
0.51
0.56 0.06
0.17
0.15 芪归5:1
芪归3:3
芪归1:5 0.33
0.54
0.23 0.15
0.17
0.07

11.3对环磷酰胺作用下小鼠血浆中铁、铜元素含量的影响
小鼠体重18～22g,雌雄各半,分组、给药方式和剂量同上。于给药的第4、5两天同时腹腔注射环磷酰胺100mg/kg·d,第8d给药后1h摘眼球采血,测定血浆中Fe、Cu元素的含量。结果芪归5:1组(当归补血汤组)和当归组的Fe元素含量明显高于对照组;给当归、芪归5:1及黄芪组的Cu元素含量明显高于对照组,见表12-16-56。
11.4对乙酰苯肼作用下小鼠血浆中铁、铜元素含量的影响
小鼠18～22g,雌雄各半,分组、给药方式和剂量同上。于给药的第4d同时皮下注射乙酰苯肼100mg/kg,末次给药后1h摘除眼球采血,测定血浆中Fe、Cu元素的含量。结果当归和芪归3:3组小鼠血浆Fe元素量高于对照组,黄芪组Cu元素含量明显高于对照组,见表12-16-56。

表12-16-56 对环磷酰胺和乙酰苯肼作用下小鼠血浆中Fe、Cu元素含量的影响(ppm)

组别 环磷酰胺作用下 乙酰苯肼作用下 Fe Cu Fe Cu 生理盐水
黄芪
当归
芪归5:1
芪归3:3
芪归1:5 0.32
0.29
0.38
0.43
0.29
0.29 0.20
0.27
0.38
0.29
0.08
0.16 0.26
0.23
0.36
0.19
0.31
0.17 0.09
0.26
0.14
0.15
0.17
0.20

微量元素对机体的造血功能有很重要的作用。实验证明黄芪当归配伍可使煎液中Fe、Cu元素煎出率增加,即配伍煎液中元素含量增多;该两药单味及其某些配伍煎液,分别对正常小鼠及以环磷酰胺致造血抑制和乙酰苯肼致溶血性贫血小鼠的血浆中Fe、Cu元素含量有增高作用。其中芪归5:1配伍(当归补血汤)对环磷酰胺致贫血模型小鼠血浆中Fe、Cu含量增高明显些,芪归3:3配伍则对正常小鼠血浆中Fe、Cu元素含量及乙酰苯肼致贫血模型小鼠血浆中Fe元素含量增高明显些,此可能亦为补气药黄芪、补血药当归单用或作为气血双补药对用于临床的依据或机制之一。
另有数篇有关当归补血汤加味的片剂、口服剂的药理研究[62,63]。
【临床应用】
1.补血作用
1.1治疗贫血
邹氏等对220例小儿营养性贫血患者采用归芪口服液和归芪丸治疗,结果归芪口服液临床显效率92.8%,明显优于丸剂(69.8%),能明显改善贫血症状,升高Hb.SF及血清Fe、Zn浓度,降低FEP。^[64]加味当归补血汤对慢性肾衰引起贫血有较好的疗效^[65]。
1.2治疗白细胞减少症
接受放化疗的病例分成不用生血药、用利血生或鲨肝醇等用生血药以及生血药加当归补血汤3组,每组各10例给以治疗观察。结果表明骨髓抑制减轻以加用当归补血汤组最好,该组中无一例放化疗失败患者,全部完成疗程。提示本方对骨髓抑制有一定防治作用^[66]。
以本方加三棱、甘草治疗原因不明白的白细胞减少症20例,并设对照组20例。中药日1剂:对照组用利血生20mg,每日3次,均服药3～4周。结果:治疗组显效8例,有效11例,无效1例,总有效率95%;对照组显效1例,有效10例,无效9例,总有效率55%。中药组疗效明显优于对照组。且对照组无效病例给予本方治疗仍有效^[67]。又报道15例原因不明白细胞减少症患者,随机分为当归补血汤、当归补血汤加三棱、对照(蜂乳胶囊以及多种维生素)3组。各组自身前后外周血白细胞计数显示,较之对照组比较当归补血汤组能明显提高白细胞数,差异显著,加三棱组也有显著差异^[67]。
陈氏^[58]将本方用于治疗精神病药所致的白细胞减少症,许氏等本方加味治疗放疗白细胞减少证均有佳效^[69]。
1.3 血小板减少性紫癜
基本方由黄芪、血余炭各30g,当归10g,甘草、仙鹤草各15g组成,随症加减。治疗慢性原发性血小板减少性紫癜24例。结果临床治愈7例,显效12例,有效5例,平均服药64d^[70]
2.治疗妇产科疾病
2.1 治疗崩漏、功能性子宫出血
任氏用当归补血汤合失笑散、三七粉治疗60例崩漏证,疗效显著。60例中,年龄在12～20岁者19例,21～45岁者22例,46～50岁者15例,51岁以上者4例;病程在2个月以内者15例,2个月以上至6个月者28例,6个月以上至1年者10例,1年以上至2年者4例,2年以上者3例;出血类型属青春期功血18例,生育期功血16例,更年期功血14例,子宫肌瘤5例,子宫内膜增殖症2例,腺性囊肿2例,产后及引产后各1例,老年原因不明者1例。予当归补血汤:当归、黄芪各30～50g,出血量多色红者,当归用量酌减;失笑散:五灵脂、蒲黄各20g,出血量多者均炒用,量少者均生用;三七粉6～8g(分2次冲服。)血热者加黄芩,肝肾不足者加续断。48例显效(服药3～7剂,出血即止);9例有效(服药14剂以上,出血止后,在15d之内再次出血,续服本药血止者);3例无效(服药20剂以上,出血时断时续者)。
陈氏^[72]用当归补血汤加味治疗崩漏51例。门诊病人32例,住院病人19例;年龄最小45岁,最大51岁,平均48岁;月经紊乱时间最长5年,最短半年,平均2年8个月;就诊时阴道流血持续时间:最长3个月,最短20d,平均40d。阴道流血呈多如崩者27例,阴道流血量少漏下不止者24例,全部病例经妇科及B超检查盆腔未发现器质性病变,诊断性刮宫,病理报告为:“子宫内膜增生过长”。同时测基础体温为单相表现。51例西医均诊断为更年期功能失调性子宫出血。中医辨证属肾阴虚型24例;肾阳虚瘀阻胞宫型15例;气不摄血瘀滞胞宫型12例。方用当归补血汤加味:当归10g,桑叶20g,黄芪30g,三七粉3g,何首乌15g,川续断15g。加减:肾阴虚型加女贞子15g,旱莲草15g,枸杞子10g;肾阳瘀阻胞宫型加巴戟天10g,鹿角霜10g,炒蒲黄10g;气不摄血瘀滞胞宫型加党参20g,白术12g,炒蒲黄10g,益母草10g;瘀血明显症见阴道流血淋漓不止,有血块,色暗黑者,加地稔根15g,岗稔根15g,炒蒲黄10g。每日1剂,水煎服,中药服至阴道流血停止后改六味地黄丸合归脾丸,连服3～6个月。按《中医病证诊断疗效标准》中崩漏的疗效标准判定,治愈:经量、经期、周期恢复正常,能维持3个月经周期以上,或更年期妇女血止绝经者。好转:经量、经期、周期虽恢复正常,但不能维持3个月经周期,或经量减少,或经期缩短。未愈:阴道出血无变化。治疗结果:治愈25例,其中肾阴虚型9例,肾阳虚瘀阻胞宫型8例,气不摄血瘀滞胞宫型8例。好转20例,其中肾阴虚型12例,肾阳虚瘀阻胞宫型4例,气不摄血瘀滞胞宫型4例。未愈6例,其中肾阴虚型3例,肾阳虚瘀阻胞宫型3例。总有效率88%。治愈患者中服当归补血汤加味最多15剂,最少3剂,平均6剂;服六味地黄丸合归脾丸最多4个月,最少1个月,平均2个半月。
当归补血汤加味治疗功能性子宫出血50例,患者病程18～45年不等。治疗方药:生黄芪、当归各30g,田三七(水磨汁)、桑叶各10g。血竭气脱者加人参(水磨汁)10g,阿胶(烊化)15g;瘀血重者,加五灵脂,炒蒲黄(布包同煎)各6g。每日一剂,水煎分2～4次缓缓温服。结果临床好转(崩血停止,月经周期正常,持续1年内无复发)42例,6例好转(崩血停止3个月,月经正常,以后复发者),2例无效[73]。
另有多篇治疗崩漏的报道[74～76]。
2.2治疗产后缺乳
陈氏[77]用本方加味治疗产后缺乳,无论是气血不足,还是肝气郁滞均收到满意效果,方药组成及用法:生黄芪30g,当归10g,白芷12g,红花6g,黄酒100ml。用水600ml,将生黄芪、当归、白芷、红花先浸泡10min左右,文火煎煮至300ml,将药液滤出,再加水400ml,文火煎煮至200ml,滤出药液,两料兑一起,将黄酒兑入药液中,分2次服,每日1剂。在服完汤药后,用双手轻轻按揉乳房15min至半个小时。待全身微微欲汗方可停按。痊愈:乳汁分泌旺盛,足以满足婴儿需要。有效:乳汁分泌增加从无到有。无效:治疗前后无变化。痊愈40例,有效7例,无效1例。服药2剂有效者34例,服药3～4剂有效者10例,服药5～6剂有效者3例。就诊最早者产后5d,最迟者75d。一般产后缺乳时间越短,疗效越快也越好。
2.3 治疗产后便秘
李氏治疗产后便秘19例,年龄最小者21岁,最大者39岁,干部11例,工人8例;其中自然分娩12例,剖腹产7例。方剂用当归补血汤加味:黄芪50g,当归50g,麦冬50g,沙参25g,五味子25g,生地50g,枸杞子25g,火麻仁25g,郁李仁25g,茯苓30g。1日1剂,水煎分2次服。本组19例,临床均告治愈。其中服药1剂后即解硬结大便者3例,3剂后解羊粪样便者10例,5剂后排便者6例^[78]。
2.4治疗其他妇科疾病
本方合桂枝茯苓丸加减治疗12例子宫肌瘤。结果痊愈6例,好转5例,无效1例^[67]。
以本方加味治疗月经过多属气不摄血者42例,获显著疗效。其中治愈31例,好转7例,无效4例^[79]。以本方加味对79例妇女更年期综合征进行治疗,并设有对照组76例,结果治疗组治愈61例,治愈率75.37%;与对照组疗效比较差异极显著(P<0.01)^[67]。
另有治疗闭经泌乳综合征等症的报道^[80～82]。
3.治疗椎-基底动脉缺血性脑病。
用加味当归补血汤治疗40例椎-基底动脉缺血性脑病,主要表现:眩晕40例,伴恶心干呕者30例;近1周内发生过晕厥者13例;发作性肢体活动不灵或一惯性语言不利者19例;偏侧肢体麻木者20例,双侧肢体麻木者9例;头痛者15例;视物障碍表现为一过性黑蒙者15例;视野缺损4例。发病因素:平素低血压者15例,颈椎病10例,高脂血证、脑动脉硬化8例,多发性脑梗死4例(CT诊断),心脏病(包括心律不齐、心功能不良)3例。40例病人均属老年人,平均年龄55岁。方用生黄芪30g,当归15g,龙眼肉12g,鹿角胶12g(烊化冲服),丹参30g,乳香6g,甘松9g,明天麻12g。加减:低血压加桂枝15g;颈椎病加鹿衔草30g;高脂血症、脑动脉硬化加何首乌30g、草决明30g;肢体麻木加秦艽12g、威灵仙15g;头痛头重加川芎12g、羌活9g;苔黄腻加黄连6g、胆南星9g。水煎服,每日1剂。3d为1疗程,用药两个疗程评定疗效。稳定3个月无复发为治愈;无晕厥发生,眩晕减轻,生活能自理为好转;诸证无好转为无效。按以上疗效标准治愈26例,好转14例,总有效率100%^[83]。
4.治疗溃汤性结肠炎
选择慢性溃疡性结肠炎59例,随机分为治疗组31例,对照组28例。59例中男29例,女30例。年龄22～63岁。病程最短半年,最长13年。全部病例均符合全国消化系统学术会议制定的诊断标准,均经纤维结肠镜等检查。病变部位:直肠、乙状结肠者26例,直肠、乙状结肠、降结肠者17例,乙状结肠、降结肠、横结肠者11例,全结肠者5例。59例中合并肠息肉者2例,肠腔狭窄者2例。症状体征:59例中每日腹泻4次以上者50例,腹痛者48例,腹胀者23例,左下腹部压痛者41例。实验室检查:大便常规均有数量不等的红白细胞,血常规、血色素低于正常者26例(治疗组14,对照组12例)占44%,免疫指标体液免疫59例均在正常范围,细胞免疫E玫瑰花结低于正常者48例(治疗组26例,对照组22例)占81%。治疗组和对照组年龄、病程、血象、免疫指标均无显著性差异P>0.05。治疗组:一般疗法:常规给予高蛋白、高维生素、高碳水化合物、低渣食物。急性发作期予以静脉补液维持水与电解质平衡。感染征象明显者予以抗菌素控制感染。药物灌肠:云南白药、锡类散、654-2各1支加入37℃100ml温水中保留灌肠,每日1次,用10d停5d,2个月为1疗程。当归补血汤加味:黄芪50g,当归10g,绞股兰茶20g,橄榄果20g,香菇20g,丹参30g,川芎10g。湿热型加白头翁30g,脾虚型加干姜5g,便血加三七粉15g。每日1剂水煎,早晚分服。2个月为1疗程。对照组:一般疗法和药物灌肠同治疗组。肠炎灵片每日2.6g,用10d停5d,2个月为1个疗程。停肠炎灵后服用中成药止泻冲剂每次10g,每日3次,连用5d。治愈:临床症状消失,血、便常规、免疫指标正常,肠镜等检查肠粘膜病变恢复正常。随访3个月未复发。好转:临床症状消失,实验室各项指标正常,肠镜等检查肠粘膜病变明显改善,随访3个月复发;或未复查肠镜等,随访观察3个月未复发者。无效:治疗前后症状、体征、实验室检查及肠镜等检查无明显改善。治疗结果及有效率:治疗组治愈5例占16%,好转23例占74%,总有效率为90%。对照组治愈1例占3.6%,好转17例占60.7%,总有效率为64.3%,P<0.05^[84]。
5.治疗风湿性关节炎
何氏报道^[85]51例,男32例,女19例,年龄16-65;行痹15例,着痹12例,热痹5例,痛痹19例。治疗方药:黄芪35g,当归25g,桂枝15g,海风藤10g,秦艽10g,制川乌6g,水煎内服,每日1剂,10d为1疗程,服2个疗程后再用上方倍量泡酒服,以巩固疗效。加减法:痛痹加细辛3g,着痹加防己8g,薏苡仁30g,行痹加防风9g,羌活8g,热痹去制川乌、海风藤加知母10g,忍冬花20g。结果:51例中,治愈(关节肿瘤、肢体麻木消失、活动自如)36例,好转(肿瘤、麻木基本消失,但活动轻展受限)10例,无效5例。疗程最短10d,最长45d。本方对痛痹和着痹治疗效果较好,对热痹的疗效欠佳。
朱氏等以本方加味治疗风湿性关节关节炎53例,疗效满意^[86]。
6.治疗肝损伤
在肾病综合征的治疗中,强的松为首选药,但长期应用易损害肝脏(药物性肝),影响肾病综合征的治疗和缓解。传统治疗常采用保肝药或递减强的松用量的方法。韩氏等^[87]将30例已出现肝损害患者用当归补血汤加味治之,及25例一开始治疗就加服该汤剂病人与50例用激素治疗者进行临床观察对比。随机选择55名肾病综合征患者(出现肝损后加服当归补血汤加味30例,治疗一开始并服该汤剂者25例)做为治疗组,将50例本病常规用药者做为对照组,进行临床对比。105名患者中男68名,女37名;年龄14～46岁,确诊时间2个月～3年,平均3.15月。病例选择:105名患者均符合1985年全国肾小球疾病临床分型标准中的肾病综合征诊断标准。住院后必需作肝功、HBsAg、乙肝五项检查以排除病毒性肝炎,治疗中每周查肝功1次,共4次。中药以当归补血汤加减:当归8g,黄芪40g,白术15g,柴胡15g,生地、党参各30g,煎200ml,日1剂,分2次口服,30d为1疗程。对照组常规保肝药。30例出现肝损患者加服当归补血汤加味后其症状及体征(食欲不振、恶心、肝区不适,ALT上升)消失时间与对照组比较P<0.01,结果见表12-16-57。

表12-16-57 两组患者肝损症状、体征消失时间比较(例)

　 例数 1周 2周 3周 加服中药治疗组
对照组 30
25 6
0 18
3 4
8

加服中药3组周后症状、体征消失者共28例,占93.3%,仅有2例症状、体征未消失。而对照组3周后症状、体征消失11例占32%,14例未完全恢复。两组对比显著性差异。25例同服当归补血汤加味患者在治疗过程中均未出现肝损,而对照组2周后肝损3例,4周后4例。经统计学处理,两组对比有显著性差异(P<0.01)。
7.治疗其他
袁氏用当归补血汤撤减强的松一例^[88],以本方加味,外加用椰树油或鲜椰子汁搽局部治疗斑秃^[89]、局限性水肿^[90]、慢性舌炎、口腔炎、视网膜炎、心动过速^[91]、末梢神经炎^[92]、复发性口疮^[93]、老年性皮肤瘙痒^[94]、冠心病^[95]、室性早搏[96]、病毒性肝炎^[97]、肾小球肾炎并发肾衰^[98]、尿血^[99]。
有报道以本合五子衍宗丸化裁治疗男性不育13例,治愈10例,显效2例,无效2例^[100]。