13.附子 干姜 甘草 : 【中医理论】
附子1枚(10g),生用,去皮,破8片,干姜1两(9g),炙甘草2两(6g),名“四逆汤”,见于《伤寒论》。附子,大辛大热,入心脾肾经,温肾状阳,祛寒救逆;干姜、辛热,归肺脾与心经,可温中散寒,助阳通脉,干姜与附子,而者相须为用,助阳散寒之力尤大,故有“附子无姜不热”之说。配伍炙甘草为佐使,性温具补,补脾胃而调诸药,且可缓姜附燥烈辛散之性,使其破阴复阳,而无暴散之虞。诸药配伍共奏回阳救逆之功效,主治:少阳病。四肢厥逆,恶寒卷卧,呕吐不渴,腹痛下利,神衰欲寐,舌苔白滑,脉微;或太阳病误汗亡阳。用法:以水三升,煮取一升二合,去滓,分温再服。强人可大附子1枚、干姜3两。
【化学研究】
1.制备工艺
1.1 滴丸
选取基质为PEG 6000(或4000),将干姜挥发油吸附混合后熔融,加入附片、甘草混合提取物,混匀保温于90±5℃。用内口径3.5mm,外口径5.0mm的滴管,以22～26粒/min的滴速滴入甲基硅油中,收集滴丸,吸除冷却剂即可^[4]。
1.2 口服液
上3味药,附子、甘草加水煮2次,第1次2h,第2次1.5h,合并煎液,滤过。干姜通水蒸气蒸馏提取挥发油,另器保存,姜渣再加水煎煮1h,煎液与蒸馏分离挥发油的溶液合并,滤过,再与附子、甘草的煎液合并,浓缩至约400ml,放冷,加乙醇1200ml,搅匀,静置24h,滤过,减压浓缩成稠膏状,加水适量稀释,冷藏24h,滤过,加单糖浆300ml、防腐剂适量与上述挥发油,再加水至1000ml,搅匀,灌装,溶封,即得^[5]。
1.3 新型汤剂
附子粉碎成细粉,以1%盐酸水提取,适当浓缩后,以95%乙醇加至含醇量70%左右,静置24h过滤,回收乙醇,浓缩液60℃真空干燥后密闭。每克相当生药2.6g。甘草以2%稀氨水提取,适当浓缩后以稀盐酸沉淀,离心过滤后,干燥、粉碎、密闭包装。每克相当生药3.0g。干姜适当粉碎后以水蒸馏法提到挥发油,残渣加水煎煮,煎煮液浓缩后醇沉,回收乙醇,真空干燥,粉碎后淋入挥发油密闭包装。每克相当生药2.0g(加适当赋型剂)。使用时按标示量取上药混合冲入60～80℃温开水^[6]。
2.质量控制
2.1 鉴别
附子:取除去沉淀的四逆汤口服液,用氨水碱化至pH9,用30ml乙醚-氯仿(2:1)混合液分二次萃取。合并萃取液,挥去溶剂。残渣用1ml无水乙醇溶解。取溶液5μl,点于硅胶G板或硅胶GF254板上,以石油醚-氯仿-95%乙醇(2:4:3)为展开剂,以改良Dragendorff试剂为显色剂,呈明显色斑^[3]。
甘草:取四逆汤滴丸加水,酸化后的甘草酸沉淀用乙醇溶解即得样品。以正丁醇:醋酸:水(6:1:1)为展开剂,展开,用10%H2SO4乙醇液为显色剂,100℃加热即显色^[2]。
2.2含量测定
2.2.1总生物碱
滴定法测定:样品的制备:精密量取四逆汤剂10.0ml于分液漏斗中,加10%氨水2ml,用25ml乙醚萃取,萃取3次,合并乙醚提取液,55℃左右回收溶剂,低温蒸干,加中性乙醇5ml,微热溶解,待测定。样品的测定:在待测定的样品液中准确加入0.0217mol/L硫酸液10.00ml,振摇片刻,加入重新煮沸后冷却的蒸馏水15ml,加甲基红指示剂2滴,用0.0413mol/L氢氧化钠液回滴至溶液由淡红变为淡黄色,即为滴定终点。以乌头碱计算总生物碱的含量。每1ml0.217mol/L的硫酸液相当于28mg的乌头碱^[3]。
离子双萃取分光光度法:标准品曲线绘制:吸取乌头碱标准液0.01097mg/ml不同量,按一定方法操作,以选定波长测定,得回归直线方程:C=4.0383A+0.0926,r=0.9944。样品制备:取滴丸,加水,同乌头碱TLC制备方法。残渣加酸水溶解,定容10ml,即得样品。样品测定:精密吸取样品2.0ml,置分液漏斗中,加蒸馏水1.0ml,溴麝香草酚蓝指示液2.0ml,pH6.0的邻苯二甲酸氢钾缓冲液5.0mI,氯仿10ml,振摇3min,静置1h,分出氯仿液,过滤。同法以蒸馏水3.0ml作空白试验,以氯仿作空白,样品UV扫描图与乌头碱标准液一致,由选定的条件测定,将测定值查标准曲线或代入上述回归直线方程计算样品中乌头生物碱的含量^[2]。
2.2.2乌头碱
TLC—比色法:样品制备:取滴丸加水酸化后过滤,滤液碱化,以乙醚氯仿萃取,萃取液于低温挥于,取残渣用乙醇溶解即得样品。样品测定:取样品,以乙醚:氯仿:甲醇(1:2:1)为展开剂,展开,用碘蒸汽为显色剂。先以乌头碱标准液测定TLC的检出灵敏度,再由样品呈现明显斑点的最少点样量计算滴丸中乌头碱的限量^[2]。
HPLC法(高效液相色谱法):标准曲线绘制:精密称取乌头碱对照品5.7mg于量瓶中,氯仿溶解并稀释至刻度,进样1.0,2.0,3.0,4.0,5.0μl。再精密吸取上述溶液1.0ml置瓶中,用氯仿稀释至刻度,摇匀,进样2.0,4.0,6.0,8.0μl。以所得的乌头碱色谱峰的面积值与进样量(μg)作图,二者呈良好的线性关系。其线性回归方程为:Y=18033.64X+223.34,r=0.995.乌头碱水解产物对照溶液的制备:精密称取乌头碱对照品约2mg,置2ml安瓿中,加水1ml,置水浴上蒸干,残余物加氯仿溶解并定量移至2ml量瓶中,加氯仿至刻度,作为加样回收率试验的对照品溶液。样品的制备及测定:取四逆汤颗粒剂12g左右,精密称定。加蒸馏水30ml,加热溶解后加入乙醇130ml,混匀,过滤。滤液减压回收蒸干。加稀盐酸5ml于残渣中,超声处理10min,过滤于分液漏斗中,残渣再用稀盐酸洗涤4次,每次3ml,各超声处理5min,过滤于同一分液漏斗中,用浓氨水调节pH9～10。氯仿提取3次,依次为20,10,10ml,合并氯仿液,回收蒸干,残余物加入0.1%三乙胺一甲醇(2:8)1.0ml溶解,过滤。滤液作为供试品溶液。以乌头碱为标准来测定供试品中乌头碱水解产物的含量。乌头碱对照品进样6μl,样品进样10μl,乌头碱水解产物对照品进样2μl。取供试品溶液10μl,连续三次注入液相色谱仪,结果测定面积均值为13224,RSD为0.77%。查标准曲线或代入上述线性回归方程得样品中乌头碱水解产物的含量〔3〕。
2.2.3双酯型毒型生物碱改良的异羟肟酸反应(高氯酸铁显色分光光度法)
标准液制备及标准曲线绘制:精密称取乌头碱标准品20.0mg,溶于无水乙醇中,转入10ml容量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,即得2mg/ml的乌头碱标准液。精密量取乌头碱标准液0,0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ml分别置于25ml容量瓶中,以无水乙醇补足2.50ml,各瓶中均加入碱性盐酸羟胺试液1.5ml,65℃水浴中保温10min,取出冷至室温,加高氯酸铁试液12.5ml,振摇使生成的氢氧化铁溶解,准确加入pHO.5高氯酸水溶液8.00ml,用高氯酸铁试液稀释至刻度,混匀,放置显色20min后,于UV—190上515nm波长处,用光程长度为1cm的比色皿测定吸收度,得回归直线方程:Y=4.43×10-3+0.0868X(r=0.998,n=7)并绘制标准曲线。样品液制备:精密量取汤剂10.00ml于分液漏斗中,加10%氨水2ml,加乙醚萃取3次,每次25ml,合并乙醚萃取液,55℃左右回收溶剂,低温蒸干,加无水乙醇溶解,转入10ml容量瓶中,无水乙醇稀释至刻度,备用。样品测定:精密量取上述样品液2.5ml于25ml容量瓶中,依标准曲线制定的方法进行测定,将测定值代入回归直线方程或查标准曲线即得含量。
2.2.4 甘草酸:聚酰胺柱分离(UV分光光度法测定)
标准曲线的绘制:精确吸取不等量甘草酸胺标准液,用80%的乙醇和1mol/L NH4 OH乙醇各50%的混合液稀释定容,以溶剂为空白,以选定的测定条件测定,即用岛津UV-240型分光光度计,在扫描的基础上,于最大峰附近,变化波长和狭缝以寻找最大吸收,最后选定吸收波长252.0nm,狭缝2nm。得回归直线方程为:C=0.9563A-0.0010,r=0.9996。样品制备:取滴丸加水,酸化后过滤,沉淀再经碱化、酸化精制处理,含甘草酸的沉淀用80%乙醇溶解定容,即得样品。样品测定:吸取样品0.1～0.2ml,加到预处理好的聚酰胺柱上端。待样品流至柱床上仅有一薄层时,用80%乙醇4ml左右洗脱;继用1 mol/L NH4 OH乙醇液洗,收集此洗脱液80%乙醇定容。用上述选定的条件测定,以测定值查标准曲线或代入回归直线方程即得含量^[2]。
【药理研究】
1.对血压的影响
对实验所致心源性休克有明显的升压作用。对家兔经耳缘静脉1次注入3%戊巴比妥1mg/kg,使颈动脉压降至5.33kPa,心输出量下降至50%左右。静脉给予四逆汤2g(生药)/kg,颈动脉压和心输出量明显提高,并可减轻戊巴比妥对心率的抑制。耳缘静脉1次注入大肠杆菌O55B5内毒素冻干制剂8～10mg/kg,造成家兔内毒素性休克,可见到血压下降至6.67～9.33kPa,并可出现各种快速心律失常,呼吸频率增快达原来的2倍左右,球结膜微循环出现明显的功能障碍。静脉注射本药2g/kg,可使动脉压明显回升,并减轻内毒素休克,机体代偿呼吸增快。随着血压回升,微血管中血流速度加快,红细胞电泳速度增快,皮肤温度回升。对实验性休克小肠有良好的保护作用。阻断肠系膜上动脉,造成家兔原发性小肠缺血损伤性休克和继发性小肠缺血性损伤的晚期失血性休克。通过十二指肠给药途径与本药煎剂40ml(相当于生药5g)。结果休克动物血压下降值较对照组明显降低,血压明显升高,腹腔渗出液显著减少。解剖动物可见给本药组小肠病变明显减轻,色泽红润,出血点极少,无大片坏死,对照组则小肠粘膜色泽发暗,弥漫出血,有多发性溃疡及大片坏死^[1]。
2.对心脏功能的影响
使心脏心肌收缩幅度明显增大。用离体兔心乳头肌观察四逆汤对心肌基本生理特性的影响。结果,加药5min时达高峰,可维持30min以上,振幅平均增大8%,进一步加大剂量,对离体兔心乳头肌收缩幅度无明显影响。对心肌的兴奋性、自律性,不应期亦均无明显影响^[8]。对麻醉家兔在体心肌能明显增加其收缩力^[7]。对离体兔心肌实验亦观察到本药能使心肌收缩幅度明显增大。给药组其心脏收缩幅度为27.6±3.29mm,对照组仅为14.5±0.95mm,同时可使冠状动脉血流呈明显增加,而心率无明显改变^[8]。对在体及离体蟾蜍心脏可使其收缩频率略减慢而振幅增高,收缩强而有力,可对抗水合氯醛和缺钙造成的心脏抑制,使心脏收缩增强。在离体兔心动物实验中也观察到同样的结果,可使水合氯醛造成的心脏抑制明显减弱,心率增加42%^[7]。此外,用本药后对放血所致的低血压状态家兔,可使其心脏收缩幅度比给药前增加7.46±5.00%(P<0.05)。而心率由给药前170.25±45.46次/min减慢为153.00±43.77次/min(P<0.05)。并且可使颈动脉收缩压升高3.28±1.50kPa,脉压差增加0.60±0.43 kPa(P<0.01)。拆方研究表明,附子虽有明显的强心作用,但其作用不如全方,且可导致异位性心律失常。甘草无强心作用,但升压效应较为明显,干姜则强心、升压作药均不明显。3药合用成复方后,强心升压作用强于各单味药,并能减慢窦性心律,降低附子的毒副作用。由此证明本方配伍组合的合理性。具体体现了“附子无干姜不热,得甘草则性缓”这一祖国医学论说^[7]。另据药效动力学研究表明,四逆汤有抗实验性心率减慢的作用,先给小鼠腹腔注射心得安80mg/kg后再给本药,30min后测心率,给药量0.6,2.6g/kg的小鼠心率次数为265±47,315±39,365±39,对照组为249±46,两相比较,P值分别为>0.05,<0.01,<0.01。表明四逆汤能对抗心得安减慢心率的作用,此效应在一定范围内呈剂量依赖关系。同时还测得用本药后1～8h内药物效应及相应体存量均随时间延长而下降。由此说明,四逆汤抗心得安所致心率减慢的作用能在一定程度上反映回阳救逆的效应^[8]。
3.对心肌的保护作用
3.1 对心肌代谢的影响
对心肌匀浆脂质过氧化反应(LPO)有抑制作用。经处死小鼠心生理盐水匀浆TBA法对脂质过氧化物(MDA)测定表明,当药物组浓度分别为1g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml时,对MDA含量的抑制率分别为24.8、24.4、15.9,与对照组相比,P值分别为<0.05、<0.01、<0.001,表明本药不同剂量对心肌匀浆的LPO有不同程度的显著抑制,抑制率随剂量加大而上升。四逆汤在体内也可显著降低缺血心肌氧自由基浓度和MDA含量。另外,组成四逆汤的单味药附子和甘草对LPO也有显著抑制作用,而干姜则无此作用,根据抑制率大小,依次为附子>甘草>干姜。实验中还发现,本药对O2有清除作用,当药物组浓度每3ml中分别为5mg、10mg、25mg、100mg时,对OER的清除率为23.9%、34.8%、58.7%、68.3%、71.7%,表明不同剂量的四逆汤对OFR均有不同程度的清除率,清除率随剂量加大而上升。本方中各单味药对OFR也有清除作用,根据清除率大小,依次为附子>甘草>干姜^[9]。又四逆汤能使缺血小鼠心肌超氧化物岐化酶(SOD)活性增加。经对小鼠缺血模型服用本药后,用邻苯三酚法测定心肌SOD活性。结果,本药组SOD活性为110.5±12.2U,缺血组为95.2±9.7U,对照组为114.8±16.6U,与缺血组比较SOD活性增加有显著性差异(P<0.05)。该方对MDA含量的降低、对OFR的清除和对SOD活性的增加这些作用,表明四逆汤可削弱缺血心肌中自由基损伤性反应,而增加自由基防御因素,具有对缺血心肌的保护性效应^[10]。
3.2抗缺血心肌脂质氧过氧化的作用^[11]
3.2.1 缺血加四逆汤(SD)抗缺血心肌MDA作用的量效关系
实验按完全随机设计分5组:根据四逆汤(SD)剂量(每天ml/20g)分为0.025,0.05,0.1,0.2共4个剂量组,每组n=7～8,对照组n=8,雌雄兼用。各药组且按剂量用SD灌胃,对照组用等量蒸馏水灌胃。连续处理3d后各组与对照组复制心肌缺血,腹腔注射垂体后叶素,剂量20U/kg,注射后60min取出心脏,在1～4℃条件下将心肌制成10%的生理盐水匀浆,用TBA法测定心肌MDA含量,见表6-13-1。

表6-13-1 四逆汤抗缺血心肌脂质过氧化作用的量效观察(±s)

分组 剂量(ml/20g) n 心肌MDA含量(nmol/0.1g) P 对照组　 8 71.5±12.9　 四逆汤组 0.25
0.05
0.1
0.2 7
8
8
8 69.9±5.8
51.2±17.7
52.8±10.0
55.1±9.9 >0.05
<0.05
<0.01
<0.05

3.2.2 四逆汤抗缺血心肌LPO作用的时效关系
实验分6组:对照组(n=8),处理同上。根据用药天数分为1,2,3,5,7(d)5个用药组,每组n=7～8,SD用药量为每天0.1ml/20g,灌胃,最后一次用药后24h复制心肌缺血并测定心肌MDA含量,方法同上,结果见表6-13-2。
3.2.3 四逆汤全方对缺血心肌MDA含量的影响
实验分3组:对照组,单纯缺血组(简称缺血组),缺血加SD组(简称SD组)。各组n=8,雌雄各半。SD组用SD灌胃,剂量每天0.1mg/20g,对照组与缺血组则用等量蒸馏水灌胃。连续处理3d后,SD组与缺血组复制心肌缺血,方法同上,对照组腹腔注射等量注射用水。注射后60min,各组剖取心脏,测心肌MDA含量,方法同上,结果见表6—13—3。

表6-13-2 四逆汤抗缺血心肌脂质过氧化作用的时效观察(±s)

分组 给药天数 n 心肌MDA含量(nmol/0.1g) P 对照组　 8 71.5±12.9　 四逆汤组 1
2
3
5
7 8
8
8
7
8 73.5±10.3
61.7±2.7
52.8±10.0
50.9±3.2
56.3±2.4** >0.05
<0.05
<0.01
<0.01
<0.01

注:与5 d组相比* * P<0.01。

表6-13-3 四逆汤全方对缺血心肌MDA含量的影响(±s)

分组 心肌MDA含量nmol/0.1g 对照组
缺血组
四逆汤组 48.6±5.9
71.5±12.9**
52.8±10.0**

注:n=8,与对照组比:* * P<0.01。
3.2.4 四逆汤各单味药对缺血心肌MDA含量的影响
实验分5组:对照组,缺血组,附子组,干姜组,甘草组。各组n=8,雌雄各半。对照组,缺血组处理同上。各单味药组分别灌以相应的单味药水煎液(浓度1 g生药/ml),剂量每天0.1 ml/20 g,连续灌药3 d,3 d后复制心肌缺血,并测定心肌MDA含量,方法同上。全方及各单味药作用强度采用MDA生成抑制率表示:

结果见表6-13-4,表6-13-5。

表6-13-4 四逆汤各单味药对缺血心肌MDA含量的影响(±s)

分组 心肌MDA含量nmol/0.1g 对照组
缺血组
附子组
干姜组
甘草组 48.6±5.9
71.5±12.9**
57.2±4.9**
66.8±2.9**
59.3±6.2**

注:n=8,与对照组比:**P<0.01
4.对心肌血流量的影响
对缺血心肌营养性血流量(NBF)可增加其供血的作用。经对小鼠腹腔注射垂体后叶素20U/kg,用86Rb示踪摄取法测定NBF表明,四逆汤组86Rb摄取率为1.56±0.24,对照组为1.65%±0.14,显著大于对照组。这表明本药能改善心肌的缺血(氧)状态,这可能是四逆汤保护缺血(氧)心肌的机制之一^[12]。

表6—13—5 四逆汤各单味药对缺血心肌MDA生成的抑制率

分 组 心肌MDA生成的抑制率% 四逆汤全方组
附子组
干姜组
甘草组 81.7
62.4
20.3
53.3

5.对缺血心肌能量代谢的影响
昆明种小鼠,体重23±1g。完全随机设计,分正常对照组(简称对照组)、单纯缺血组(简称缺血组)、缺血组加四逆汤组(简称SD组),各组n=8,雌雄各半。SD煎制同前,组成SD汤的各单味药均经鉴定,符合国家药典(1990年版一部)的药用规定。SD水煎液终浓度1g生药/ml。SD组用SD灌胃剂量每天0.1ml/20g,对照组和缺血组用等量蒸馏水灌胃。各组连续处理3d后,缺血组与SD组腹腔注射垂体后叶素,剂量20g/kg,对照组腹腔注射等量注射用水。注射后1h,断头取心,分别测定如下指标。
心肌三磷酸腺苷(ATP)含量采用高效液相(HPLC)测定。色谱条件:色谱柱μBondapakC18,300mm×3.9mm(ID),10μ美国(WATER公司);流动相:0.05M(NH4)3PO4,pH=6.0;流速:0.8ml/min,检测波长254 nm,进样25μl。心肌丙二醛(MDA)浓度,采用TBA法测定。心肌糖原含量,采用蒽酮显色法测定。上述实验数据采用t检验及直线相关分析进行处理。
缺血心肌ATP含量和MDA浓度的变化见表6-13-6。缺血心肌ATP含量与MDA浓度之间的直线相关分析。表6-13-6结果表明心肌缺血使心肌的ATP含量显著减少,与此同时脂质过氧化反应增强,MDA浓度显著上升,两者呈显著的负相关关系。
缺血心肌糖原含量和乳酸浓度的变化见表6-13-7。缺血心肌糖原含量与乳酸浓度的直线相关分析。表7-13-7结果表明,缺血心肌糖原含量显著下降,乳酸浓度显著上升,且两者呈高度的负相关。

表6-13-6 四逆汤对缺血心肌ATP含量和MDA浓度的变化(x±s)

分组 ATP含量(μg/0.1g,MC) MDA浓度(nmol/0.1g,MC) 对照
缺血 (n=8)131.8±22.4
(n=8)103.2±20.9 48.6±5.9
62.2±3.9 显著性检验 t=2.643
P<0.01 t=5.403
P<0.01

表6-13-7 四逆汤对缺血心肌糖原含量和乳酸浓度的变化(x±s)

分组 糖原含量(mg/100g,MC) 乳酸浓度(mg/100g,MC) 对照
缺血 (n=8)413.16±66.6
(n=8)251.0±59.8 6.43±0.73
8.93±1.35 显著性检验 t=5.122
P<0.001 t=4.787
P<0.01

SD对缺血心肌ATP含量的影响(表6-13-8)。SD对缺血心肌MDA浓度的影响见表6-13-9。SD对缺血心肌糖原含量的影响(表6-13-10)。SD对缺血心肌乳酸浓度的影响见表6-13-11^[13]。

表6-13-8 四逆汤对缺血心肌ATP含量的影响(±s)

分组 ATP含量(μg/0.1g,MC) 显著性检验 缺血组(n=8)
四逆汤组(n=8) 103.2±20.9
121.4±15.6 t=1.974
P<0.05

表6-13-9 四逆汤对缺血心肌MDA浓度的影响(±s)

分组 MDA浓度(nmol/100g,MC) 显著性检验 缺血组(n=8)
四逆汤组(n=8) 62.2±3.9
50.6±3.2 t=6.4444
P<0.05

表6-13-10 四逆汤对缺血心肌糖原含量的影响(±s)

分组 糖原含量(mg/100g,MC) 显著性检验 缺血组(n=8)
四逆汤组(n=8) 251.0±59.8
398.9±35.3 t=6.0374
P<0.01

表6-13-11 四逆汤对缺血心肌乳酸浓度的影响(±s)

分组 乳酸浓度(mg/100g,MC) 显著性检验 缺血组(n=8)
四逆汤组(n=8) 8.93±1.35
6.88±1.10 t=2.050
P<0.05

6.对心电图的影响
对垂体后叶素引起的家兔缺血性心电图有显著的改善作用。对家兔经耳缘静脉注射垂体后叶素(Pit)1μ/kg,然后用本药灌胃,剂量为每天2ml/kg,然后再用1次Pit,对注射Pit前后的T波高度、ST段基础值进行自行对比;对用本药前后T波,ST段的变化进行组间对比。结果,在用本药之前Pit注入后引起了ST段显著降低和T波显著升高(P<0.05)表明注射Pit引起缺血性ECG是明确的;使用本药后ST段的下移显著减轻,T波的增高明显受到抑制,这表明本药具有显著改善缺血性ECG的作用。四逆汤还对低张性缺氧小鼠的心肌有保护作用。采用低气压(26.7kPa相当于海拔9000m以上)造成低张性低氧血症,引起心肌缺氧。结果表明:与对照组相比,本药组CEAT有显著延长。在相同缺氧环境下,对照组15min停电率高达80%,而四逆汤组无1例发生、两者差异极为显著(P<0.01)^[12]。
7.对心肌缺氧性应激耐受力的影响^[14]
昆明种小鼠,分青年对照组(简称Y组,3月龄)和老年组(简称E组,17月龄)。老化对心肌缺氧性应激的耐受力的影响:将Y,E2组动物(每组n=8,雌雄各半)分别置36.37kPa(275mmHg)低气压环境下,用LMS-2B二导生理记录仪,记录标准Ⅱ导联心电图,计测心电活动时间(Cardioelectric activity time,CEAT)和15 min内停电率(简称停电率)。结果见表6-13-12。
表6-13-12 老化对缺氧小鼠CEAT的影响(x±s,气压36.67kPa)

组别 n CEAT(min) CEAT<15min CEAT>15min CEAC率 青年组
老年组 8
8 19.5±8.3
8.2±3.5** 1
7 7
1 12.5%
87.5%

注:与青年组比较:* * P<0.01
老化对心脏自由基的影响:迅速剖取Y,E两组动物(每组n=6)的心脏,用预冷(4℃)生理盐水冲洗,滤纸吸净心脏表面残液,然后迅速置液氮中,用于氧自由基(OFR)浓度的测定,OFR浓度采用电子自旋共振(Electrospin resounance,ESR)法,测毕标本解冻,用于心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定(邻苯三酚自氧化法)和心肌丙二醛(MDA)含量测定(TBA法)。结果见表6-13-13。
表6-13-13 老化对小鼠心脏自由基的影响

组别 n OFR(hg11,mm) SOD(U/0.1g,MC) MDA(nmol/0.1g,MC) 青年组
老年组 6
6 3.38±3.56
7.17±2.66* 118.24±14.4
101.4±9.2* 47.3±6.6
61.5±6.7**

注:与青年组比较:* P<0.05,* * P<0.01
药物对老年心脏耐受缺氧性应激的影响:SOD:E组动物,随机分为SOD和生理盐水2组,每组n=8,SOD组从尾静脉1次性注入SOD酶活性比3000U/mg蛋白生理盐水溶液0.1ml/20g,SOD生理盐水溶液浓度为0.5mg,ml;生理盐水组尾静脉注射等量生理盐水。10min后2组均置33.33kPa(250mmHg)环境下接受缺氧应激并计测CEAT和停电率。TP:E组动物,随机分为ATP和生理盐水2组,每组n=8,ATP组腹腔注射ATP,剂量0.4mg/20g,生理盐水组腹腔注射等量生理盐水,15min后2组处理过程同上。四逆汤(SD):E组动物随机分为SD和生理盐水2组,每组n=8。SD组用SD灌胃,每日剂量0.1ml/20g,生理盐水组用等量生理盐水灌胃,连续3d,最后1次灌胃后1h,2组处理过程同上。结果见表4-15。SD煎制方法同前,SD水煎液终浓度1g生药/mI。SD各单味药(附子、干姜、甘草)。均经鉴定,符合国家药典要求(1990年版一部)。
表6-13-14 SOD,ATP,四逆汤对老年小鼠心脏耐受缺氧应激的影响(±s,气压33.33kpa)

组别 n CEAT(min) CEAC率(%) 生理盐水组
SOD组
生理盐水组
ATP组
生理盐水组
SD组 8
8
8
8
8
8 8.5±4.1
13.8±4.5*
8.2±3.6
18.4±4.3**
8.7±4.5
16.5±3.4** 87.5
37.5*
87.5
0***
75.0
12.5*

注:与生理盐水组比:* P<0.05,* * P<0.01
实验数据用x±s表示,采用t检验和Fish精确检验法进行处理。
8.抗自由基保护应激老年小鼠心脏的作用
昆明种老年小鼠(17～20月龄),随机分为应激组、应激加四逆汤组(简称四逆汤组)和对照组。除心肌营养性血流测定各组n=8外,其余指标测定各组n=6,每组雌雄各阗。四逆汤组用四逆汤(1g生药/ml)灌胃,剂是每天0.1ml/20g体重,应激组与对照组用等量蒸馏水灌胃,连续处理3d后,四逆汤组、应激组被置入跑笼内。然后置4℃环境中应激1h。平时饲养室温22±2℃。对照组除不应激外其余处理过程与前面2组相同。经上述处理后各组测定以下指标:心肮营养血流(NBF)、氧自由基浓度(OFR)、超氧化物歧化每活性(SOD)、丙二醛含量(MDA)。NBF测定用86Rb示踪摄取法、OFR浓度测定用ESR法、SOD活性测定用邻苯三酚法、MDA含量测定用TBA法。
四逆汤对应激老年小鼠心肌OFR浓度的影响:结果为心肌OFR浓度(hg11·mm),对照组为7.42±2.06(x±s),应激组为12.33±2.36,四逆汤组8.92±3.11,F检验3组均数之间差异显著(F=4.252,P<0.05)。因此进一步作Q-test,结果,对照:应激q值为3.767,P<0.05;四逆汤:应激q值为3.285,P<0.05;对照:四逆汤q值为0.482,P>0.05。结果表明四逆汤显著抑制了应激引起的心肌OFR浓度的上升。
四逆汤对应激老年小鼠心肌NBF的影响:结果为对照组86Rb摄取率(%)为1.59±0.30,应激组为1.10±0.25,四逆汤组为1.44±0.30,F检验3组均差异非常显著(F=18.52,P<0.01)。进一步作Q-test,结果应激使老年小鼠心肌NBF显著下降,而四逆汤可显著增加应激老年小鼠心肌的NBF。
四逆汤对应激老年小鼠心肌SOD活性的影响:结果为对照组心肌SOD活性(u/100mg·MC)为102.9±8.22,应激组为90.3±6.5,四逆汤组为99.7±6.7,F检验3组均数有显著差异(F=5.007,P<0.05)。进一步作Q-test,结果,对照:应激q值为4.292,P<0.05;四逆汤:应激q值为3.202,P<0.05;对照:四逆汤q值为1.090,P>0.05。结果表明应激使老年小鼠心肌SOD活性显著下降,而四逆汤则显著增加了心肌SOD活性。四逆汤对老年小鼠心肌MDA含量的影响:结果为对照组心肌MDA含量(n mol/100mg·MC)为63.1±6.0,应激组为75.1±6.6,四逆汤组为64.9±5.5,F检验3组均数间差异非常显著(F=6.526,P<0.01)。进一步作Q-test,结果,对照:应激q值为4.868,P<0.01;四逆汤:应激q值为4.138,P<0.01;对照:四逆汤q值为0.730,P>0.05。结果表明应激使老年小鼠心肌MDA含量显著增加,而四逆汤则显著降低了应激老年小鼠心肌的MDA含量^[15]。
9.对家兔实验性休克的治疗作用^[16]
9.1 四逆汤肠道给药对晚期失血性休克的疗效
选用1.7～2.5kg健康雄性家兔,在普鲁卡因局麻下完成下列操作:在十二指肠中段和回肠末端各造一瘘并置入橡皮管,颈总动脉、股动脉、股静脉各插入导管。静脉注射肝素以抗凝。水银检压计测颈动脉血压。从股动脉插管迅速放血,使血压降到40mmHg,然后采取由股动脉少量放血或回输血液,使血压维持在40mmHg2h,之后从股静脉输回全部放出的血液,再观察2h结束实验。
16只兔随机分为2组:给药组8只兔,于失代偿(需要少量回输血液才能维持血压于40mmHg)开始时,从十二指肠瘘管灌入40ml四逆汤煎剂;对照组8只兔,方法同给药组,灌注生理盐水40ml。
四逆汤煎剂由甘草、干姜、附子组成,比例为3:1:1,水煎,取头、二煎混匀,每40ml药液含生药5g(浓度为12.5%)。
结果为给药组8只家兔无1只死亡,而对照组8只家兔有4只死亡。给药组8只家兔有7只(87.5%)脱离休克(即血压≥原水平血压2/3),而对照组8只家兔仅1只(12.5%)脱离休克。两组脱离休克率有显著性差异(P<0.05)。表6-13-15示,两组最初放血量和最大放血量基本一致,但给药组剩余血量显著多于对照组,揭示给药组休克失代偿程度较轻。给药组输血后血压与对照组比较,亦有显著性增高。给药组灌注四逆汤,其血压——时间曲线显著高于生理盐水对照组。9.2 四逆汤肠道给药对SMDO休克的疗效^[16]
动物选择及肠道造瘘法同实验(1)四逆汤制剂亦同上。用无创止血钳夹闭肠系膜上动脉1h,然后开夹,恢复肠道血流造成SMDO休克模型,随机将30只兔分成3组。1次给药组:夹闭肠系膜上动脉后即从十二指肠瘘管灌注四逆汤煎剂40ml,1 h后开夹恢复血流前,从回肠瘘管排出灌肠液,并用100ml温盐水灌洗肠腔。持续给药组:夹闭肠系膜上动脉后给药方法同1次给药组,但开夹恢复肠道血流后,再灌四逆汤40ml,保留到实验结束。对照组:方法同1次给药组,以等量盐水灌肠。各组动物均观察至开夹后4h结束实验。

表6-13-15 四逆汤对晚期失血性休克输血后2h疗效的比较(±s)

组别 动物数 最初放血量
(ml/kg) 最大放血量
(ml/kg) 剩余血量
(ml/kg) 代偿时间
(分) 输血后2h血压 为原血压
(%) 下降差值
(mmHg) 给药组
对照组 8
8 15.0±1.4
17.4±1.0 23.2±1.9
25.8±3.2 22.4±2.3**
9.6±2.8 40.0±7.9
44.5±7.8 76.8±3.3**
25.7±15.7 25.5±4.8*
81.8±15.7

注:表内数字为均值±标准误(表6-13-16)。与对照组比较:* P<0.05;* * P<0.01
结果为开夹后4h,1次给药组和持续给药组各10只家兔的死亡率分别为3只(30%)和2只(20%),而对照组10只家兔的死亡率为7只(70%),经统计学处理,持续给药组死亡率较对照组显著降低(P<0.05)。1次给药组和持续给药组脱离休克率均为3只(30%),而对照组10只家兔中无1只家兔脱离休克。1次给药组和持续给药组腹腔渗出液呈血性者分别为4只(40%)和5只(50%),而对照组为8只(80%)。表6-13-16示,不论1次给药组或持续给药组,开夹后4h的血压及血压下降差值均较对照组明显降低,腹腔渗出液亦较对照组明显减少。持续给药组疗效比1次给药组更好一些。将肠系膜上动脉开夹后,两给药组的血压一时间曲线较对照组明显抬高。结束实验后解剖动物,肉眼所见的小肠病变,给药组明显减轻,粘膜色泽仍红润,出血点极少,无1只兔有大片坏死,而对照组小肠粘膜色泽发暗、弥漫出血,常常有多发溃疡及大片坏死^[16]。

表6-13-16 四逆汤对SMDO休克各组开夹后4h血压和腹腔渗液的比较

组别 动物数 血压值为原血压(%) 血压下降差值(mmHg) 腹腔渗液(ml/kg) 1次给药
持续给药
对照 10
10
10 34.8±8.3*
47.5±8.5**
8.2±4.5 66.2±9.1**
55.2±9.2**
99.6±4.2 2.9±0.5**
3.0±0.4**
5.3±0.6

注:方差分析处理,与对照组比较:* P<O.05;* * P<0.01
10.对免疫功能的影响
本方能对抗免疫抑制,有免疫激活作用,使血清IgG含量提高。给大鼠肌注氢化可的松每天1.5mg/100g,连续7d,造成大鼠机体免疫功能抑制。在注射氢化可的松的第2d,同时灌服本药煎剂(按附子:干姜:甘草以5:3:2的比例制成100%煎剂),结果氢化可的松可明显抑制大鼠的免疫功能,其血清IgG平均含量为1.30±0.32mg/ml,给药组为4.05±1.16mg/ml,对照组为2.60±0.60mg/ml。说明四逆汤能明显对抗氢化可的松的免疫功能抑制。此外也有实验证明,附子、干姜、甘草三者均能显著提高氢化可的松造成的IgG下降,附子还可将IgG水平提高到正常水平以上,但就作用强度来说,单味药都比全方要弱,这证明了四逆汤三药组合配伍的科学性和合理性[7,17]。
对血清IgG水平的影响:SD纯种大鼠,雄性,38只,体重250～300g,随机分5组:四逆汤组n=8;附子组n=8;干姜组n=8;甘草组n=7;对照组n=7。附子、干姜、甘草按5:3:2混合后组成四逆汤全方,生药共重200g,加水1000ml,文火煎至200ml(1g生药/ml)。四逆汤组每天用此煎液灌胃,剂量0.5ml/100g体重。附子、干姜、甘草各单味药按每味药200g加水1000ml煎至200ml(1g生药/ml)。单味药煎液灌胃,剂量均为每天0.5ml/100g体重。对照组用同量蒸馏水灌胃。各组均连续灌药6d,第7d断头取血测定血清IgG。四逆汤组与对照组相比以显示四逆汤对血浆IgG水平的影响,各单味组与对照组相比以显示各味药的作用,并比较他们的强度大小。
IgG的分离,纯化,测定:取大鼠血清1.5ml,与等量饱和(NH4)2SO4,磷酸盐缓冲盐水溶液(PBs)混合沉淀后离心(4 000 r/min,20 min),取沉淀物用3.0 mlPBS溶解后加饱和(NH4)2SO41.5 ml离心(同上),重复1次,沉淀部分用1.5 mlPBS溶解置透析袋内,透析至无游离铵离子,然后将样品用二乙氨乙醇DEAE纤维素柱过柱处理,洗脱液用751-紫外分光光度计测定光密度,根据下式求出IgG含量。
IgG含量(mg/ml)=(1.45×OD280-0.7×OD260)×稀释倍数
四逆汤全方对正常大鼠血清IgG水平的影响见表6-13-17。

表6-13-17 四逆汤全方对正常大鼠血清IgG水平的影响

组别 血清IgG水平(mg/ml) 显著性检验 t值 P值 四逆汤
对照 5.5±1.1
2.6±0.6 5.709 <0.01

从表6-13-17 可知四逆汤可显著提高正常大鼠血清IgG水平(P<0.01)。
单味药物对正常大鼠血清IgG水平的影响见表6-13-18。从表6-13-18可知各组间差异非常显著,为进一步明确各单味药的作用并对比各单味药作用的大小,在上述F-检验的基础上,进一步作Q-检验结果,干姜和附子均可显著提高正常大鼠血清IgG水平。见表6-13-19在四逆汤中各单味药作用强度的比较。

表6-13-18 单味药物对血清IgG水平的影响

　 血清IgG水平(mg/ml) 显著性检验 干姜
附子 5.6±1.1
4.4±1.1 F=37.03 甘草
对照 1.6±0.2
2.6±0.6 P<0.01

表6-13-19 四逆汤各单味药作用强度的比较

比较组 Q值 P值 干姜
干姜
附子 甘草
附子
甘草 13.49
4.411
9.082 <0.01
<0.01
<0.01

从表6-13-19可知干姜、附子、甘草三者的作用效价有显著的差异,三者的作用强度从大至小依次为:干姜、附子、甘草^[18]。
11.对肾上腺皮质的作用
由参胆四逆汤(人参皂苷、附子总碱、干姜挥发油、猪胆酸组成)行大鼠腹腔注射,能显著降低肾上腺中维生素C的含量,还能显著对抗大鼠的蛋清性关节肿胀及增加小鼠血浆皮质醇含量^[7]。
12.对环核苷酸含量的影响
昆明种健康小鼠62只,18～22g,雌雄兼用,随机分成对照组,四逆汤组,四逆组+CY组,CY组。给药方法为对照组每天生理盐水0.5ml灌胃连续14d;四逆汤组,每天以四逆汤0.1×LD50量0.5ml灌胃,14d;四逆汤+CY组,正式实验有6d,腹腔注射CY300mg/kg,隔日1次,共3次,四逆汤剂量及给药途径同四逆汤组;CY组,于正式实验前6d,腹腔注射CY30mg/kg,隔日1次,共3次。按文献方法处理样品,将处理后的血浆及淋巴细胞样品按中国原子能研究所提供的H-cAMP3,H-cGMP竞争放射分析试剂盒说明书进行实验,待反应结束后,用LKB-1217型液体闪烁计数仪进行测定,计算出样品中的cAMP及cGMP含量,全部数据以方差分析,组间两两比较q检验,进行统计学处理。
淋巴细胞内及血浆中cAMP及cGMP的含量结果见表6-13-20。

表6-13-20 四逆汤对淋巴细胞内和血浆中cAMP和cGMP的影响(x±s)

组别 n 淋巴细胞内(nmol/1010cell) 血浆中(nmol/L) cAMP cGMP cAMP cGMP 对照组
四逆汤组
四逆汤+CY组
CY组 15
15
16
16 9.35±3.16
7.95±2.66ΔΔ
7.39±1.87ΔΔ
12.38±3.4* 2.45±2.23
1.09±2.34
1.69±2.31
0.93±1.38* 17.57±4.69
25.10±3.86**
23.87±4.75*
25.71±4.59** 2.70±1.73
2.85±1.28
2.85±1.28
2.77±0.84

注:与对照组比:* P<0.05,* * P<0.01;与CY组比:△P<0.05,△△P<0.01,(下同)
从表6-13-20可见,经CY处置的免疫功能低下小鼠淋巴细胞内cAMP含量明显高于对照组,cGMP含量明显低于对照组,四逆汤对正常小鼠淋巴细胞内cAMP和cGMP含量无明显改变作用,但能明显降低免疫功能低下小鼠淋巴细胞内cAMP含量,升高其cGMP含量,使二者达正常对照组水平。
从表6-13-20还得知,四逆汤组和CY组小鼠血浆中cAMP含量均明显高于对照组,而且四逆汤升高正常小鼠血浆中cAMP含量的程度与环磷酰胺升高血浆cAMP含量的协同作用;且CY所致的免疫功能低下小鼠与四逆汤组小鼠血浆中的cGMP含量均无明显改变。
淋巴细胞内及血浆中cAMP/cGMP的比值结果见表6-13-21。

表6-13-21 四逆汤对淋巴细胞内和血浆中cAMP/cGMP比值的影响(x±s)

组别 n cAMP/cGMP 淋巴细胞内 血浆中 对照组
四逆汤组
四逆汤+CY组
CY组 15
15
16
16 4.90±1.01
6.61±1.32*ΔΔ
5.45±1.41ΔΔ
10.67±0.87** 7.60±2.97
7.45±1.42Δ
8.00±1.95Δ
10.21±1.22*

从表6-13-21可见:CY明显提高小鼠淋巴细胞内及血浆中cAMP/cGMP的比值;四逆汤也能明显提高正常小鼠淋巴内cAMP/cGMP的比值,且能降低免疫功能低下小鼠淋巴细胞内及血浆中cAMP/cGMP的比值至正常对照组水平,但对正常小鼠血浆中cAMP/cGMP的比值无明显影响^[19]。
13.对家兔隔肌功能影响
家兔乌拉坦麻醉、剑突下分离膈肌条,记录膈肌的机械活动及电活动变化。动物随机分为膈肌机械活动组,单侧气胸组和电活动组。观察用药前及用药后5,10,30及60min膈肌机械活动及电活动的变化。结果:四逆汤2mt/kg腹腔注射后,5min呼吸频率减慢,膈肌收缩幅度增加(P<0.05);10min时,呼吸频率明显减慢,吸气时间(Ti)延长(P<0.01),积分曲线峰值(Peak)增加(P<0.05)。30min后,呼吸频率,膈肌收缩幅度,Ti,peak及积分曲线斜率(slop)均显著增加(P<0.05～P<0.01)。结论:四逆汤可使膈肌电活动增强,收缩力增加^[25]。
14.对动脉粥样硬化家兔脂代谢及血管内皮功能的影响
研究结果表明:四逆汤可明显缩小主动脉内膜脂质斑块面积,降低血清总胆固醇三酰甘油,低密度脂蛋白-胆固醇。载脂蛋白B及血浆内皮素浓度,提高血清ND及载脂蛋白A含量,四逆汤高剂量组效果为佳,呈一定的量效依赖关系^[26]。
15.体内动力学过程
15.1 以毒性为指标测定本药的表观药动学参数
用LD50补量法对四逆汤的毒效半衰期进行了测定。经判断本药在体内的经时性变化符合二室模型,计算得出四逆汤分布相的半衰期为0.35 h,消除相半衰期为5.8h^[20]。
15.2 以抗实验性心率减慢为指标,测定本药的药效动力学参数
抗心率减慢量效关系的测定。将小鼠腹腔注射心得安后随机分组。对照组腹腔注射生理盐水,各给药组腹腔注射不同剂量的四逆汤。结果,心得安组心率明显减慢,四逆汤组抗心得安减慢心率的效应在一定范围内呈剂量依赖关系,直线回归分析,四逆汤的量效关系式为y=43.4X+286.44,r=0.9997。四逆汤的对数剂量与抗心率减慢效应呈良好的正相关。时效和时量关系测定。将先用心得安腹腔注射的小鼠设5个时间组,各鼠均1次性腹腔注射同样量的药物后分测其心率。代入上述直线回归方程式,以推算出给药不同时间后药物的体存量。结果:1～8h内药物效应及相应体存量均随时间延长而下降。将给药时间t及对应的药物体存量R(t)输入计算机处理。并将各种模型的处理结果进行比较,显示所测药物均相当于静脉给药的二模型。说明腹腔给药后很快进入血液循环。依上述关系绘制四逆汤的药时曲线,其分布相、消除相半衰期及其他一系列药动学参数为:T1 2a(h):0.56,T1/2β(H):6.67,A(g/kg):3903.24,B(g/kg):1374.55^[21]。
15.3 抗炎、镇痛的药效与剂量,药效与时间的关系
抗炎效应的量效标准曲线:以容积法选合格大鼠,分别腹腔注射给药,30min后于一足跖中部皮下注射10%鲜蛋清0.1ml。然后测定不同时间大鼠该侧踝关节下容积,并计算各组肿胀率及肿胀抑制率。选取生理盐水组肿胀达高峰时各组的肿胀抑制率作为药效指标,绘制对数剂量——抗炎效应曲线。四逆汤:Y=-46.73+39.12X(Y-肿胀抑制率,X=1n剂量)。说明抗炎作用强度与药量呈正相关。
ED50补量法测药效半衰期:依法算出的抗炎实验的ED50,另给大鼠先注射四逆汤负荷量(D)4g/kg,6h后分别给腹腔不同剂量的药物,对照组给生理盐水。在给药后30min于大鼠一中跖中部皮下注射10%鲜蛋清0.1ml,测定大鼠该踝关节下容积,计算肿胀抑制率。据数据按法算出ED50。ED50±L95(g/kg):11.8±3.94。ED50±L95(g/kg):9.06±2.88,存留系数K:0.77。抗炎效应的半衰期:11.35h。
剂量—镇痛效应标准曲线绘制:以热板法选大鼠,不等量腹腔注射四逆汤及等容量生理盐水。给药后每隔30 min测一次痛阈,2h后每小时测一次痛阈,选取各组痛阈提高最大值,绘制对数剂量一镇痛效应标准曲线,四逆汤:Y=-125.14+61.68X(Y=痛阈提高百分率,X=1n剂量)。表明四逆汤的镇痛效应强度与剂量呈正相关。
镇痛效应—时程关系:以上法选小鼠,分别腹腔注射本药40g/kg,等容量生理盐水。给药后测定不同时程阈值,以痛阈提高百分率作为药效指标。将时间(t)及对应的药效(Rt)输入计算机进行处理。将各种模型的处理结果进行比较,判定所测药物均符合静脉注射后的二室模型。药效消除相半衰期为6.84h,消除速率常数为0.6h-1,r值为0.92。此外,实验中还发现附子镇痛效应半衰期较四逆汤长,抗炎效应半衰期较四逆汤短。这似乎说明附子、四逆汤的镇痛,抗炎成分并不相同,也说明了附子与甘草、干姜配伍后的药效作用规律起了变化^[22]。
【临床药理研究】
1.抗心肌缺血作用^[8]
全部病例选住院病例。参照全国内科学术会议《关于冠心病命名及诊断标准的建议》,选择有典型心绞痛反复发作、常规心电图有典型缺血性ST-T改变者30例,随机分成两组:四逆汤组15例,男9例,女6例,年龄(55±10)岁;硝酸异山梨酯(ID)组15例,男8例,女7例,年龄(53±9)岁。所有入选病例均先停用有关抗心绞痛药物5个半衰期,然后分别给予下列药物(单盲给药):四逆汤组:附子10g,甘昌4g、干姜6g,加水500ml,煎至250ml,2次/d;ID组:ID10mg,3次/d。两组疗程均为两周。每3d一次详细询问心绞痛发作时间、次数、程度、持续时间、诱发因素和劳累程度。每天测定1次心率和血压。两组病例均在用药前和用药后2周抽血做如下检查:丙二醛(MDA),用硫代巴比妥酸法测定;超氧化物岐化酶(SOD),用邻苯三酚法测定;血脂、血糖、电解质、肝肾功能和血常规。用药前和用药后2周做12导联心电图观察其改变。
用药前和用药后2周做超声心动图检查,分析下列指标变化:心输出量(CO);左室射血分数(LVEF);左室舒张末期容量(LVEDV)。同等劳累程度不引起心绞痛或心绞痛发作次数减少80%以上为显效;心绞痛发作减少50%～80%为有效;心绞痛发作次数减少不到50%为无效;心绞痛发作次数增加为加重。总有效率=显效率+有效率。两组疗效差别的比较用x2检验,其它计量资料应用t检验。显著性水平P值限定为0.05。

表6-13—22 两药对心绞痛发作次数及持续时间的影响(±s)

组别 例数 发作次数(次/周) 持续时间(min) 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 四逆汤组
硝酸异山梨酯组 16
15 11±9
12±8 3±4**
3±4* 17±11
15±10 5±6**
6±5**

注:与本组治疗前比较:* P<0.05,* * P<0.01
结果为:SD对心绞痛发作的总有效率为60%(9/15),其中显效27%,有效33%;ID组为66%(10/15),其中显效33%,有效33%;两组差异无显著意义(P>0.05)。表6-13-22结果示:两药均可减少心绞痛发作次数及持续时间(P<0.05),但两药的作用无差别(P>0.05)。

表6-13-23 两药对心电图ST段的影响(x±s)

组别 例数 治疗前(mm) 治疗后(mm) 四逆汤组
硝酸异山梨酯组 15
15 -1.01±0.36
-1.12±0.40 -0.51±0.35**
-0.54±0.38**

注:与本组治疗前比较:* * P<0.01
测量标准Ⅱ导联和胸前V5导联的ST段位置,然后取两者均值作为该例ST段变化的定量指标进行分析。表6-12-23结果示:两药均使缺血性压低的ST段有所恢复(P<0.01),但两药对ST段影响无差别(P>0.05)。

表6-13-24 两药对血清MDA和SOD的影响(x±s)

组别 例数 MDA(μmol/L) SOD(U/L) 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 四逆汤组
硝酸异山梨酯组 15
15 5.59±0.96
5.15±0.33 4.01±0.48**
4.94±0.65Δ 232.4±20.8
224.2±21.1 283.6±17.6**
228.8±19.1Δ

注:与本组治疗前比较:* * P<0.01;与SD组治疗后比较:△P<0.05

表6-13-25 两药对心功能的影响(±s)

组别 例数 CO(L/min) LVEDV(L) LVEF 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 SD
ID 15
15 5.53±1.70
5.62±1.25 6.57±1.83*
6.38±1.12* 0.12±0.03
0.12±0.02 0.10±0.03**
0.10±0.01** 0.52±0.09
0.53±0.08 0.60±0.08*
0.58±0.08*

注:与治疗前比较:**P<0.05
表6-13-24结果表明:SD使患者血清中的MDA降低和SOD升高(P<0.01),而ID则无此作用(P>0.05),两组比较差别有显著意义(P<0.05)。
表6-13-25结果表明:两药均能提高CO和LVEF、降低LVEDV(P<0.05),从而改善心功能。尽管SD的作用略优于ID,但两组比较无显著意义(P>0.05)。
两组治疗前后的血常规、肝肾功能、血脂、血糖及电解质、心率、血压均无明显变化(P>0.05)。
2.对经皮冠状动脉成形术血液流变性的改善作用
全部患者46例,均有不同程度的心绞痛发作,经冠脉造影证实脉管径狭窄≥70%,符合“冠心病的诊断参考标准”,并完成PTCA术。将患者随机分为给药组和对照组,每组各23例。服药组男18例,女5例,年龄55～64岁,平均58.5±2.3岁,病程13个月～10年,平均5.4年。对照组男20例,女3例,年龄52～63岁,平均56.1±2.1岁,病程11个月～10年,平均5.2年。两组患者临床特征相似,具有可比性。
研究采用的四逆汤口服液,每瓶25ml,含有附子10g,干姜4g,炙甘草6g,保存期为12个月,药物鉴定符合国家药典(1990年版一部)的药用规定。两组患者术前均接受相同的常规治疗(主要用药为硝酸酯类药扩张冠脉,禁用钙拮抗剂和β阻滞剂等药),服药组于术前3d开始服用四逆汤口服液,每天1次,每次25ml,直至术后第3d。对照组不服用四逆汤,作为空白对照病例。
观察指标:于术前未服药时和术后第3d分别采空腹静脉血4.5ml和0.8ml,进行血液流变学测定:全血表观粘度(低、中、高3个切变率下);全血粘弹性(低、中、高3个切变率和G1、G2、G33个模型下);血浆粘度;红细胞聚集指数(A1>L/H和A2<B/P);屈服应力(全血、血浆);血沉率和血沉K值。统计学处理:实验数据采用前后配对t检验。
两组全血表观粘度和血浆粘度的变化见表6-13-26。服药组和对照组的血浆粘度,术后与术前相比较,无显著性变化。对照组的全血表观粘度术后与术前相比较,亦无显著性变化。但服药组的全血表观粘度在低、中、高3个切变率下,术后比术前显著降低,差异有统计学意义。说明四逆汤能显著降低全血表观粘度。

表6-13-26 两组全血表现粘度和血浆粘度测量结果(±s)

组别 例数 全血表观粘度(mPa·s) 血浆粘度
(mPa·s) 低切 中切 高切 服药
(23)
对照
(23) 术前
术后
术前
术后 21.36±0.95
18.13±1.67*
19.54±1.46
18.51±1.13 6.32±0.18
5.61±0.27**
6.26±0.33
5.96±0.22 4.73±0.10
4.35±0.15*
4.43±2.89
4.47±0.12 1.49±0.01
1.38±0.01
1.36±0.01
1.36±0.01

注:与本组术前比较:* P<0.05,* * P<0.01
两组全血粘弹性的变化见表6-13-27。对照组除G1模型的中切变率术后比术前显著的降低,差异有统计学意义外,其余的测定值术后与术前比较,无统计学差异。但服药组的G1、G2、G33个模型在低、中、高3个切变率下,术后比术前显著地降低,差异有明显的统计学意义(P<0.01),说明四逆汤能显著降低全血粘弹性。

表6-13-27 两组全血粘度弹性的测量结果(±s)

组别 G1模(比) G2模(比) IGI模(比) 低切 中切 高切 低切 中切 高切 低切 中切 高切 服药
(23)
对照
(23) 术前
术后
术前
术后 5.45±0.30
4.26±0.41**
5.21±0.47
5.21±0.76 7.42±0.39
5.84±0.51**
7.86±0.65
6.43±0.38* 20.58±0.90
16.87±1.14**
20.24±1.57
17.12±0.89 12.42±0.52
10.37±0.79**
12.01±0.83
11.71±0.94 16.07±0.64
13.46±0.86**
15.06±1.09
13.35±0.59 47.96±2.11
40.32±2.18**
45.86±2.64
41.38±1.58 13.67±0.59
11.21±0.88**
13.16±0.95
12.80±0.75 17.49±0.72
14.48±0.96**
16.41±1.24
16.15±0.68 50.45±1.69
43.55±2.48**
50.13±3.02
48.77±1.86

注:与本组术前比较:* P<0.05,* * P<0.01
两组细胞聚集指数、屈服应力、血沉率及血沉K值的变化见表6-13-28。反映血沉变化的两个指标为血沉率和血沉K值,服药组和对照组的术后与术前比较,无显著性改变。反映红细胞聚集和微循环最小动力两个指标为红细胞聚集指数与屈服应力,服药组术后比术前均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);但对照组术后与术前比较,则无显著性变化。说明四逆汤能降低红细胞聚集性物推动微循环所需的最少动力,改善血液循环^[23]。

表6-13-28 两组红细胞聚集指数、屈服应力、血沉率和血沉K值测量结果比较(x±s)

组别 红细胞聚集指数 屈服应力(mPA) 血沉率
(mm/h) 血沉K值 A1·L/H) A2(B/P) 全血 血浆 服药
(23)
对照
(23) 术前
术后
术前
术后 4.54±0.16
3.82±0.16**
4.29±0.20
4.15±0.20 15.36±0.71
12.33±0.71*
14.38±1.18
13.69±0.91 5.27±0.26
4.58±0.21*
4.46±0.40
4.57±0.21 8.16±0.31
7.38±0.30*
6.95±0.57
6.78±0.51 22.01±2.71
21.12±3.14
22.78±3.25
21.17±5.58 68.33±9.10
68.36±10.3
66.89±10.7
64.91±11.1

注:与本组术前比较:* P<0.05,* * P<0.01
【毒理研究】
本方(附子:干姜:甘草为4:3:3)小鼠腹腔注射LD50为5.82±0.599g/kg,口服LD50为17.42±1.024g/kg,与本方相比二者相差4.1倍。甘草或干姜与熟附片共煮可使附子毒性大为降低,毒性降低与所含生物碱含量关系不大^[7]。
【临床应用】
1.治疗泄泻
用本方加黄连微火煎至80ml,过滤加糖适量煮沸备用。5个月以下每次5ml,6～10个月每次5～ml,1～1.5岁每次8～ml,每4h服1次。治疗70例小儿泄泻患者,症见大便溏薄,微热,肢冷,脉微弱,苔薄白。服药后,结果痊愈58例(每日排便次数在3次以下,精神活泼,食欲正常),有效8例(每日排便次数在5次以下,精神食欲显著好转),无效4例,总有效率为94%,治愈日期最长者有7d,最少者只1d,平均治疗时间为4天^[8]。另谢氏有用本方加味治霉菌性肠炎等泄泻的报道^[7]。
2.治疗胃下垂
张氏等以四逆汤为主方,随证加减治疗7例胃下垂,若兼腹痛加肉桂、樟木子、吴茱萸;腹胀加枳实、木香、厚朴;嗳气加山楂,麦芽;恶心加砂仁、半夏。结果患者腹痛、腹胀、嗳气等主要症状均显著减轻或消失。腹部压痛及X线所见之胃张力和胃大弯位置亦有部分改善^[7]。
3.治疗十二指肠壅积症^[24]
32例均为门诊病例,其中男13例,女19例:最大45岁,最小13岁,平均年龄29岁;病程最短20 d,最长4个月;原有胃下垂3例,胃肠官能症2例。均经X光线透视确诊。有10例曾服西药按胃炎治疗无效,后改为中药治疗。属肝胃不和,升降失常21例;脾胃虚弱,中气不足11例。
全部病例均以四逆泻心汤加减治疗。基本方药组成:枳实15g,柴胡10g,白芍10g,半夏10g,人参10g,黄芩9g,干姜5g,黄连3～6g,白术10g,葛根12g,甘草6～12g,大枣5枚,每日1剂,水煎500ml。早晚分服。肝胃不和、升降失调:证见情志消沉,纳差,胁腹胀满作痛,呕吐,嗳气,舌苔黄白腻,脉弦数。用此方取其升清降浊、降逆止呕、调和肝脾之意。呕吐明显者加陈皮、白蔻仁;纳呆重者加砂仁、石菖蒲;胀痛者加香附。脾胃虚弱、升降失调:证见消瘦,乏力倦怠,面黄头晕,饮食减少,食后腹胀甚,嗳气,恶心呕吐,便溏,舌苔薄白,脉弦细或缓弱。其治清补兼用,重用炙甘草益胃调升降,除痞满,止呕吐。若仍体乏无力者加陈皮、当归、黄芪、山药。根据患者体征、症状和各项观察指征进行疗效判定。治愈:治疗后症状体征基本消失,体力增加,能正常生活并参加劳动;好转:体征症状明显好转,能生活自理,参与部分轻微劳动。治疗结果为本组32例,服药最短9d,最长24d,平均1.65d。X线透视27例壅积消失,2例胃肠神经官能症体征缓解,3例胃下垂开患者症状亦明显好转^[7]。
4.治疗心肌梗死、休克
治疗105例急性心肌梗死,其中23例并发休克,有10例采用中西医结合疗法治疗,结果无一例死亡。他们指出,对于心源性休克的亡阳型,宜用四逆汤或四逆加人参汤救治本。本方有升压、强心作用,与生脉散等中西药结合应用,可解决较长时间用升压药以停药血压下降的问题^[7]。采用中西结合疗法治疗心肌梗死休克患者50例。其中轻度休克33例,单用中药者17例,中西结合治疗13例,另3例均用西药,结果全部治愈。重度休克15例,单用西药者5例,死亡4例;中西结合或单用中药者9例,死亡3例。此外还有感染休克9例,出血性休克4例,心源性休克7例,均用中药治疗,服药后19例有效,仅1例无效^[7]。另报道治疗20例心梗并发源性休克的患者,其中17例采用生脉或四逆汤注射。结果除1例死亡外,余16例血压均恢复正常。并观察到:生脉四逆汤注入后1～20min即可见血压回升,并维持在12～14.67kPa/8～12kPa,对心率影响不大,但心音增强,脉搏有力。可使四肢厥冷,唇及皮肤灰白或青紫症状得到明显改善^[7]。另以四逆汤合生脉汤治疗急性心肌梗死低血压20例,均经心电图确诊为急性心肌梗死,其中,前壁梗死8例,前间壁梗死4例,下壁梗死8例,皆伴有低血压,收缩压8～12kPa 12例,8 kPa以下8例。用药:人参12g,熟附子10g,麦冬、五味子各15g,干姜、炙甘草各10g,水煎,日1剂,痛剧者加三七粉、降香、延胡索,汗出多者加大人参、附子用量。结果:所有病例均有血压提高,收缩压到12kPa以上者16例,4例在12kPa以下。服药3～12剂。血压提高后配合其他治疗措施。临床治愈16例,4例并发室颤死亡^[23]。
5.治疗心衰
日本学者工佐宽顺等用茯苓四逆汤治疗肺心病急性发作患儿,收到较好的效果。他们指出:服药后可迅速出现利尿现象,继之脉搏、呼吸情况也随之改善^[7]。张氏也有用茯苓四逆汤治疗风心病、肺心病所致之心衰获效的报道^[7]。
6.治疗白细胞减少症
以本方为主,酌加补血补肾之当归、熟地、枸杞、苁蓉;健脾祛湿之白术、山药、厚朴、大腹皮;止血药续断、阿胶。治疗放射性白细胞减少症8例。结果痊愈3例,显效2例,较差3例。作者认为,本方的治疗作用,可能是对骨髓的造血功能有特殊作用^[7]。