25.干姜 附子 : 【中医理论】
附姜相配,又名干姜附子汤。首载《伤寒杂病论》用于回阳,救逆。附子辛大热,禀雄壮之质,走而不守,有斩关夺将之气,为通行十二经纯阳之要药,具回阳补火、散寒除湿之功。干姜辛而大热,纯阳之味,守而不走,有温中、回阳之力。二药伍用,可使回阳救逆、温中散寒的作用大为增强。《本经疏证》谓:“附子以走下,干姜以守中,有姜无附,难收斩将搴旗之功,有附无姜,难取坚壁不动之效”。
【化学研究】^[1]
1.样品制备
取干姜10g,水蒸气蒸馏提取挥发油,另器保存,药渣与附子15g加水煎煮2次,每次1h,合并煎液。浓缩至约20ml,放冷,加乙醇60ml,静置24,取上清液挥去乙醇,加水稀释至50ml即为附子干姜溶液,取附子15g按上述方法制备成附子溶液。取附子溶液,干姜附子溶液,各10ml,各加10%氨水调pH值至8.9,用氯仿萃取2次,合并萃取液,挥去氯仿,残渣用1ml无水乙醇溶解,即得。
2.薄层分离
取上述两种溶液各10ml,点于同一硅胶G薄层板上(105℃活化0.5h,以乙醚-甲醇-氯仿(1:1:2)为溶开剂展开,取出,晾干,碘蒸显色,斑点显黄棕色。
3.乌头碱的定量分析
测定条件的选择:756MC分光光度计。测定波长为λs=410 nm,其回归方程为:A=0.0131+2.474C,r=0.9997,可见乌头碱量在0.077～0.308 mg范围内,浓度与吸收度成线性关系良好。
回收率实验:标准品回收率实验:精密量取乌头碱标准液10ml,加氨试液调pH10～11,用氯仿萃取5次,回收氯仿,残留物加少许盐酸溶解,移入10 ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀,备用。精密量取0.50,1.00,1.25,1.50,1.45,2.00 ml,依标准曲线测定方法测吸收度。结果:平均回收率为97.55%,CV=3.39%,n=6。加样回收率实验:各精密量取4 ml附子供试液,各加入乌头碱标准品1.0 ml,移入10 ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀,备用。精密量取上述供试液各2.0 ml,依法测吸收度。结果:平均回收率98.75%,CV=0.10%,n=3。
乌头碱的含量测定:取干姜附子溶液,附子溶液各50 ml,分别加氨试液调pH10～11,用氯仿萃取5次,每次10 ml,回收氯仿液,残留物加少许盐酸(1 mol/L)使溶解,移入100 ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀,备用。精密量取各供试品液2.0 ml,依上法测定,测得吸收度代入标准曲线,求出相当乌头碱的量,按下式计算乌头类生物碱含量。测得结果见表6-25-1。乌头类生物碱含量(mg/ml),=C×0.9349/2×100/50=C×0.9349(相当于乌头碱含量(mg)0.9349为换算系数,为乌头次碱与乌头碱分子量之比。

表6-25-1 样品液中乌头类生物碱含量测定结果

样品度 干姜附子溶液 附子溶液 吸收度
n
平均值
C(mg)
M(mg/ml)
CV(%) 0.478～0.483
6
0.480
0.1887
0.1764
0.40 0.647～0.053
6
0.650
0.2574
0.2406
0.38

从实验结果看出:附子与干姜配伍后乌头类生物碱含量增高36.40%,再加入甘草后,含量又下降。这一结论与“附子无干姜不热,得甘草则缓”之说是相符合的。
【药理研究】
1.对心率、小鼠动情周期、TSH和LH含量及TSH、LH和17-OHCS含量的影响^[2]
Weistar雌性大鼠,重180～220g,随机分组。对照组喂生理盐水;热药为附子(炙黑附子Radix Aconiti Late-ralis Preparata)、干姜Rhizoma Zingiberis、肉桂Cortex Cinnamomi分组:附姜桂组:附子、干姜、肉桂(1:1:1);附桂组:附子、肉桂(1:1);附姜组:附子、干姜(1:1)。加水煎煮,两次合并后浓缩,煎煮总时间超过1h。均制成100%水煎剂,每日4 ml灌胃,共2～3周。测动情周期,均选动情期后第2日断头处死,取脑、垂体、血、肾上腺等立即放低温冰箱(-20℃)内保存。
心率:3个热药组给药2周后,心率变化见表6-25-2。结果表明,对照组变化不大,附姜桂复方组第2周略微升高,但无显著性差异。小复方中,附姜组第2周也略微升高,附桂组心率不高或有下降。从心率变化来看,附姜组与附姜桂组的结果相似。另外也测量了用单味附子的大鼠,其心率明显降低,表明其抑制心率作用很强。
表6-25-2 各温热复方对心率的影响(次/min,x±s)

　 n 给药前 给药后 第1周 第2周 对照组
附姜桂组
附桂组 10
18
9 508.6±13.7
474.8±7.3
485.0±7.3 498.3±14.8 504.2±13.4
482.0±6.5
782.0±6.5 附姜组 10 511.8±9.9 510.8±9.2 520.9±11.5

注:附姜组、附桂组用药后第1周末测
动情周期变化:各组在给药前后分别测量动情周期变化,结果见表6-25-3。研究表明,热药大小复方对动情周期均有不同程度的缩短,附姜组接近于附姜桂组。附桂组虽有明显缩短,但均无统计学意义。鉴于附姜组在心率和动情周期的变化与附姜桂组相似,以下重点研究附姜组的其它方面变化。肾上腺内皮质素的变化:测定双侧肾上腺皮质素含量,结果见表6-25-4。

表6-25-3 各热药组动情周期变化(d)(±s)

　 n 给药前 给药后 第1周 第2周 第3周 对照组
附姜桂组 13
18 4.7±0.24
4.4±0.22 4.8±0.78 4.8±0.12
4.3±0.21 4.9±0.31 附桂组 10 4.4±0.17 4.2±0.12 4.1±0.01　 附姜组 18 4.7±0.18 4.6±0.12 4.6±0.15 4.6±0.18

注:附姜桂组的第1、3周,附桂组的第3周末测。
灌胃2～3周后,测定双侧肾上腺皮质素含量,结果见表6-25-4。

表6-25-4 对肾上腺皮质素含量的影响(±s)

组别 n 17-OHCS(mg/2个) 对照组 16 0.768±0.02 干附组 15 0.870±0.03*

注:与对照组比:* P<0.05,* * P<0.01(下同)
以上结果反映姜附组肾上腺内皮质素的含量高于对照组,说明肾上腺皮质的合成加速,释放量也会增多。因此附姜方有促进垂体一肾上腺系统功能的作用。
TSH含量变化:用附干方大鼠血清及垂体内TSH的测量结果见表6-25-5。

表6-25-5 大鼠血清及垂体内TSH含量变化(x±s)

组别 n 血清(μU/ml) n 垂体(μU/个) 对照组 14 167.57±15.51 18 175.28±9.09 附干组 19 197.16±18.59 16 222.75±20.28*

注:血清用药2周大鼠,垂体用药为3周,两组非同批不可相比
大鼠用附姜热药2周时血清内TSH含量升高,说明其甲状腺功能旺盛,故代谢可增强。同时垂体内TSH含量也高于对照组,因此TSH的合成加速,释放也增多。
LH的变化:大鼠用热药后,动情周期有缩短的趋势,表明垂体-性腺系统激素有改变。测量大鼠血清及垂体内LH含量,结果见表6-25-6。

表6-25-6 大鼠血清及垂体内LH含量变化(±s)

组别 n 血清(ng/ml) n 垂体(ng/个) 对照组 20 56.84±3.93 17 98.1±3.78 附干组 18 73.86±5.19* 18 139.1±6.80*

注:条件同表6-25-5
附干姜复方使LH的释放量增多,同时垂体内含量也增多,说明垂体内LH合成加速,释放也多,并有统计学意义。也说明附干姜复方能影响中枢,使丘脑下部LRH释放增多。
有报道:Wistar雌雄大鼠,体重180～220g,随机分为对照及虚热组,对照组喂生理盐水,虚热组用附子、干姜方(简称附姜)制造虚热证模型,药物均为饮片,比例1:1,制成100%的水煎剂,每日4ml(约含生药4g),灌胃2周。用药前后均选动情期后第2日大鼠,自眼眶内取血,在第2周处死大鼠取脑、肾上腺、血(血清),立即放低温冰箱(-20℃)内保存。
中枢粗提取物:已形成虚热证的鼠脑,用1 mol醋酸在冰水中研磨提取后经低温高速离心(4℃,4.8万tpm30 min),上清液分别用5%、50%硫酸铵沉淀,分为附姜2(5%)、附干姜3(50%)、附干姜4(上清液)几个部分,冷冻干燥后进行整体和离体研究。对照组脑也同时提取,步骤与上述相同。
整体实验:雄性大鼠自眼眶内取血2ml,1周后将2mg上述提取物溶解于生理盐水2 ml,经腹腔注入,注射后经6、24、48 h取血,血清在-20℃保存待测。
离体实验(垂体细胞培养实验):雄性鼠断头后,将新鲜垂体用胰蛋白酶消化后,用Hank氏液洗去胰蛋白酶,用199培养液分散和稀释为10×104的浓度。取3ml放入培养瓶,内放200μl含有200 μg提取物的生理盐水,置恒温培养箱内孵育4 h,离心后分别测定垂体细胞内及培养液的TSH、LH含量。取垂体的上清液2 ml放入分散的肾上腺细胞内再孵育4 h,离心后分别测细胞内及培养液内17-OHCS含量,以细胞及培养液总量为100,以培养液内释放的百分数反映垂体ACTH的释放功能。TSH、LH计算方法同上。
虚热证动物模型: DβH活性:基础值为34.02±4.83 μmol/L/h,虚热组为48.30±8.78 μmol/L/h。显示酶的活性增强,表明交感神经功能提高。动情周期的变化:对照组在实验过程中变化不大;虚热组的动情周期基础值为4.4±0.17日;给药后第1、2周分别为4.2±0.12日和4.1±0.01日(P<0.05),动情周期明显缩短。肾上腺内皮质素含量:对照组为0.768 ± 0.02 mg/2个肾上腺;模型组为0.879±0.03 mg/2个肾上腺(P<0.05)。根据以往的研究证明,尿内17-OHCS含量增多,此时肾上腺内含量多是合成增多的表现。TSH、LH含量:血清TSH,对照组10只大鼠为398.6±98.3μIU/ml,模型组13只大鼠为423.3 ±112.0 μIU/ml。血清LH含量:对照组17只大鼠为56.84 ±3.93ng/ml,虚热组17只大鼠为73.84±5.19ng/ml。这些变化是提高代谢和缩短动情周期的重要因素。以上结果证明,虚热证时交感神经系统和肾上腺、甲状腺系统功能提高,生殖功能紊乱,这些符合虚热证的临床表现。在此基础上进行中枢兴奋物质的提取和研究。
脑提取物的研究:整体研究:大鼠注射生理盐水后TSH含量并不升高,对照鼠脑提取物对TSH的影响也不大。虚热证鼠脑沉淀的第3部分(附姜3)在注射后第24、48 h。 DβH活性,附姜3在注入第6 h提高,附姜4在第48 h也明显提高酶活性,均有统计学意义,说明提取物有提高交感神经系统功能和TSH含量的作用,见表6-25-7。离体研究:提取物直接与垂体细胞培养后,观测对腺垂体激素释放的影响。附姜3与生理盐水组比较,TSH明显提高。附姜于3、4明显促进LH的释放,在17-OHCS的测定中附姜2比对照组明显提高,见表6-25-8。以上结果表明,附姜3在整体实验中促使TSH增多,提高DβH活性。离体实验中附姜3有促进TSH、LH的释放作用,附姜2有促进ACTH释放17-OHCS作用。附姜4也促进LH的释放〔3〕。

表6-25-7 不同提取物对大鼠血清TSH含量、DβH活性的影响(x±s)

指标与分组 鼠
数 给药前 给药后 6h 24h 48 h TSH
(μU/ml) 生理盐水
对照4
附姜3
附姜4 5
5
7
5 421.5±88.5
398.6±98.3
361.5±93.0
421.3±133.0 386.8±82.2
309.0±49.4
350.1±97.1
760.0±96.7 264.7±83.8
459.4±77.6
457.4±106.4
279.0±67.1 273.0±103.0
342.6±102.0
755.3±114.5*
494.3±179.0 DβH
(μmol/ml/h) 生理盐水
对照3
对照4
附姜3
附姜4 6
5
5
6
5 51.12±32.6
55.32±27.0
39.20±13.1
61.05±13.9
36.10±8.09 47.60±19.3
62.78±17.1
42.87±22.8
103.5±19.0*
54.00±26.5 47.13±26.6
41.33±3.11
37.30±23.3
28.10±10.8
25.30±6.56 52.80±3.81
50.80±7.40
42.58±16.9
54.10±10.8
92.30±707**

注:与给药前比较:* P<0.05,* * P<0.01

表6-25-8 中枢提取物对垂体细胞TSH、LH、ACTH释放17-OHCS(%)的影响(x±s)

分组 TSH LH 17-OHCS 生理盐水
垂体
对照2 29.1±0.3(6)
31.7±0.4(5) 49.06±2.45(6)
49.03±9.94(5) 59.00±2.45(5)
63.30±6.9(5)
51.65±7.95(5) 对照3
对照4　 50.30±3.45(4)
49.80±4.21(5) 50.45±14.80(4) 附姜2 34.4±3.0(4)　 72.44±4.93(5)* 附姜3
附姜4 38.6±2.9(5)△ 67.35±7.31(5)
60.10±2.25(5)* 65.96±22.81(6)

注:与生理盐水组:△P<0.05;与对照组比较:* P<0.05
2.对不同免疫反应强度ACTH及TSH细胞数的影响^[4]
取Wistar雄性大鼠46只,体重180～250g,随机分为对照组(10只)、实验组(36只)。实验前3周,实验组灌服寒性中药以制成寒证模型。寒性中药配方为:知母、石膏(1:1)制成1kg/L的水溶液,4ml/d,1次灌服。对照组给等量生理盐水。3周后,将实验组随机分为3组。不治疗组8只,不给任何药物治疗,称寒证组。另2组各14只,停止灌服寒性中药后,给予热性中药治疗。其中1组用附子、干姜(1:1)简称附姜组;2组用党参、黄芪(1:1)简称参芪组。以上2方均制成1kg/L的水溶液,4ml/d,1次灌服。热Ⅰ方组于治疗后5d,参芪组于治疗后5、7d(各7只),上午8～10时断头处死大鼠,取材。
切片的制备:大鼠断头处死后立即取垂体、一侧甲状腺、肾上腺、睾丸及附睾,置入用磷酸缓冲液配制的4%多聚甲醛中固定24h(4℃),再在0.01mol/L(pH7.4)的PBS中浸洗2～3d,除去多余的醛。然后按照常规脱水,透明,石蜡包埋。垂体按水平方向,从背侧到腹侧作连续切片(厚6μm),做免疫组化染色,其余组织做HE染色。
垂体免疫组化染色:按ABC法进行使用Vectastain生产的试剂盒,切片经脱蜡到水,3%甲醇-H22除去内源性过氧化物酶活性,用正常小牛血清封闭,除去外源性过氧化物酶。第1抗体用兔抗羊LH(1:1000),兔抗牛TSH(1:1000)及兔抗ACTH(1:400)4℃孵育过夜。生物素化的第2抗体(1:200),37℃孵育40min,ABC复合物(1:100)37℃孵育50min,最后用DAB-H2Q2显色约1min。特异性对照实验:用稀释的正常兔血清替代第1抗体;用PBS替代第1抗体,重复上述实验过程,结果均为阴性。
计数LH细胞、TSH细胞及ACTH细胞:计数方法为:每组取5例,每例取相应部位的1张切片,用目镜测微计和镜台推进尺,数出每例标本切片上全部的不同反应强度的细胞。胞质内充满深棕色反应颗粒的为强阳性(⫵),充满棕色反应颗粒的为阳性(⫲),只有少量浅棕色反应颗粒的为弱阳性(+)。采用行×列卡方检验方法,检验对照组与实验组之间的差别。
HE染色:甲状腺、肾上腺、睾丸及附睾均进行一般HE染色,观察对照组及实验组组织形态学的改变。
ACTH细胞的免疫组织化学变化:用抗ACTH血清所显示的促肾上腺皮质激素细胞,分散在垂体组织中,细胞较大,大小不一,成卵圆形或多角形,核大、圆,位于中心或偏位,因无免疫反应而呈圆形空白区,细胞内显示出含ACTH的棕色反应颗粒。在对照组切片上,多数细胞免疫反应很强,胞质内充满深棕色密集的颗粒,少数细胞免疫反应较弱或很弱,呈棕色或浅色。给寒性中药组的切片与对照组相比,ACTH的免疫反应明显增强,表现在大多数免疫反应的细胞都呈现强阳性,少数呈阳性或弱阳性。热药治疗后,呈阳性反应的细胞数目减少,而呈弱阳性反应的细胞数目明显增多。计数对照组和实验组不同免疫反应强度的ACTH细胞数的结果见表6-25-9。

表6-25-9 各组大鼠垂体不同免疫反应强度的ACTH细胞数比较

组别 细胞总数 不同免疫强度的ACTH细胞数　⧻　⧺ + 对照组
寒证组
附姜组5d
参芪组5d
参芪组7d 1904
1884
1115
1448
1240 936
10600*
223▲
302▲△
235 679
591
286
443
365 289
233
606▲
703▲
640▲

注:与对照组比较:*P<0.05,与对照组和寒证组比较:▲P<0.05,与附姜组比较:△P<0.01
TSH细胞的免疫组织化学变化:用兔抗牛TSH血清所显示的促甲状腺激素细胞,在对照组切片上数量明显多于ACTH细胞,其形态及分布与ACTH细胞相似。给寒性中药的切片与对照组相比,TSH免疫反应强阳性细胞明显的增多。然而在热药治疗以后,成强阳性反应细胞的数目减少。但其减少的程度没有ACTH细胞的变化那么明显。计数对照组和实验组不同免疫反应强度的TSH细胞数的结果见表6-25-10。
LH细胞的免疫组织化学变化:用兔抗羊LH血清所显示的促黄体激素细胞在数量、形态及分布上均与TSH细胞相一致;给与寒性药及热性药治疗后细胞免疫组织化学的改变亦与TSH细胞变化相同,故未加以计数。
各靶器官HE染色变化:ACTH、LH、TSH作用的靶器官分别为肾上腺束状带、睾丸的间质细胞及甲状腺滤泡细胞。通过实验组与对照组HE染色的对比观察,未发现实验组各靶器官组织细胞形态的改变。
表6-25-10 各组大鼠垂体不同免疫反应强度的TSH细胞数比较

组别 细胞总数 不同免疫强度的TSH细胞数　⧻　⧺ + 对照组
寒证组
附姜组5d
参芪组5d
参芪组7d 2903
2360
2180
2137
2255 1384
1202▲
982△
1002△
1027△ 935
838
628
389
624 584
320
498
446
604

注:寒证组与对照组比较:▲P<0.05,附姜组、参芪治疗组与寒证组比较:△P<0.05
【毒理研究】
小鼠急性毒性实验表明,附子、干姜配伍后的小鼠半数致死量(LD50)远远大于单味熟附子的LD50,差异显著^[1]。
现代实验研究对此配伍亦做了广泛深入地探索.证实了其增效作用,探明了其解毒机制。在毒性方面,小鼠的急性毒性实验表明,二者配伍后的小鼠半数致死量(LD50)远远大于单味熟附子的半数致死量,差异显著[1,5];裴妙荣等人利用薄层扫描法对附子单煎、附子干姜混煎中毒性成分含量的变化进行了测定,结果发现共同煎煮后,干姜减少了附子中3种有毒乌头生物碱含量,从而使其毒性大大降低。
【临床应用】
1.治疗精神分裂症
周氏^[6]报道:用附块120g配干姜30g,先冷浸1h后,与他药同煎20～30min服用,治疗属于阳气不足的精神分裂症患者,连用30d获愈,治疗过程无毒副作用,查心电图、脑电图、尿17-酮、17-羟等均无异常改变。
2.治疗咽痛
吴氏^[7]用干姜附子汤治疗阳虚寒滞咽痛证,疗效颇佳。上方重用附子味辛性大热,通行十二经,散寒湿,止疼痛,与干姜为伍,扶阳而敛阴,暖脾胃而散寒,上症属寒湿之邪组滞咽部,经络受阻,阳气不展,故用辛散温通之剂而奏效。
例1:朱某,男,40岁,患者6d前患风寒感冒,经治诸症大减,但遗留咽痛,曾服红霉素及肌注青霉素,咽痛不但不减,反而加重,甚至不能进食和讲话。诊见患者面色苍白,身冷恶寒,口淡不渴,不思饮食,微有咳嗽,咳吐少许白色痰液。查咽部不红不肿,扁桃体不大,咽后壁无滤泡增生,舌淡苔白,脉沉紧。证属阳虚外感寒邪,滞结于咽部所致。法当温阳散寒,拟干姜附子汤为治:熟附子15g,干姜10g。2剂,久煎频服。次日下午再诊:药未尽剂而咽痛大减,已能进食言谈,嘱其将原药服完,遂告痊愈,随访至今未复发。
例2:张某,女,55岁,患者平素四肢发凉,冬季尤其。因劳累,受寒致咽痛,时作时止近2月,虽服多种抗生素及六神丸,清热利咽之中药未见显效。严重时仅能进半流质饮食,甚为痛苦。患者形体偏胖,时值仲春,仍用头巾裹头。查咽部不红不肿,但有大量粘液丝条,舌淡苔白腻,脉沉紧。自述有恶风头痛史。拟上方治疗,2剂而愈,且头痛宿痰亦豁然痊愈。
3.其他
尹氏^[8]用附子、干姜加细辛治疗窦性心动过缓患者46例获得良效。