背景

监测活体大脑中的基因表达对于了解大脑功能、行为和神经系统疾病至关重要。由于大脑的复杂结构，传统方法面临挑战，需要非侵入性但敏感且特定的技术。有多种方法，例如磁共振成像（MRI）、超声成像和光学系统，都具有灵敏度低、难以对深部脑区域成像或多路复用的限制等局限性。

大多数研究依赖于尸检分析，这种分析无法跟踪同一动物随时间的变化。需要进一步的研究来优化和验证 RMA 在不同大脑区域和条件下的使用，确保其在不同神经学研究环境中的广泛适用性和可靠性。

关于该研究

莱斯大学的研究人员对小鼠进行了不同的研究，其方案得到了机构动物护理和使用委员会的批准，作为多项实验的一部分。这些实验是使用来自不同品系的雄性和雌性小鼠进行的，这些小鼠购自杰克逊实验室并保持在受控条件下。

第一阶段涉及质粒构建。研究人员利用特定的载体并执行了多个程序，包括消化、分离、扩增和脱氧核糖核酸 (DNA) 的提取。他们专注于通过将不同的序列插入质粒主链来创建各种构建体。这些构建体包括具有不同变体的腺相关病毒-人突触蛋白-核糖体突变体A (AAV-hSyn-RMA)、AAV-胶质纤维酸性(Gfa)-RMA、AAV-Fos蛋白(Fos)-RMA等，每个在研究中都有独特的目的。

对于细胞培养实验，使用嗜铬细胞瘤细胞系 12 (PC-12)。这些细胞在受控环境中培养，然后进行体外荧光素酶测定。类似地，培养并转染大鼠皮质源性星形胶质细胞以进行测定。在这两种情况下，转染细胞产生的生物发光都被仔细记录。

研究人员还进行了蛋白质纯化实验，利用大肠杆菌细胞转化和表达RMA蛋白。然后对这些蛋白质进行各种处理，包括离心、裂解和洗脱，以达到进一步使用所需的纯度。

该研究的一个关键部分涉及 AAV 载体的生产。这些病毒是通过用带有各种质粒的 SV40 大 T抗原(HEK293T)细胞转染人胚胎肾 293细胞，然后使用一系列复杂的程序收获和纯化病毒而产生的。

对小鼠进行立体定向注射，将蛋白质或 AAV 引入特定的大脑区域。使用精确的坐标和受控的条件仔细地进行注射过程。

使用了各种方法来评估所引入物质的影响。其中包括抽血进行荧光素酶测定、RMA 蛋白的血清半衰期以及化学给药。此外，对小鼠大脑进行组织学成像和分析，以研究分布模式以及注射物质产生的影响。

最后，研究人员将统计分析应用于数据解释。这涉及多项测试来比较数据集并确定其发现的重要性。结果被仔细记录，并使用 Adob​​e Illustrator 构建图表，说明了该研究的综合性质。

研究结果

在这项研究中，研究人员进行了多项实验来评估 RMA 在检测大脑基因表达方面的有效性。最初，测试了 RMA 穿越血脑屏障 (BBB) 的能力。它是通过将 RMA 蛋白注射到小鼠大脑的尾壳核并测定血浆浓度来实现的。

结果表明，高斯荧光素酶 (Gluc)-RMA（RMA 的一种变体）血浆浓度显着升高，这表明 RMA 从大脑到血液的转运是通过片段结晶 (Fc) 依赖性机制发生的。此外，血浆 Gluc-RMA 水平在一段时间内仅略有下降，而对照组则表现出明显的下降，这表明该生物标志物的半衰期长达几个小时，因此可以在血液中积聚。

随后，该研究探索了使用 RMA体内检测大脑基因表达的方法。研究人员将 hSyn 启动子下编码 Gluc-RMA 和绿色荧光蛋白 (GFP) 的 AAV 注射到小鼠大脑中。他们观察到血浆中信号显着增加，表明 RMA 具有检测体内基因表达的能力。实验在不同的大脑区域进行，如尾壳核、Cornu Ammonis 1 (CA1) 和黑质。

研究结果显示，所有三个区域的信号均比基线高 20,000 倍以上。此外，信号水平持续到第三周，可能是由于血浆 Gluc-RMA 达到稳定状态。研究还表明，Gluc-RMA 可以可靠地检测小鼠大脑中大约 0.001% 的神经元。

在评估 RMA 的安全表达水平时，该研究的重点是确定能够最大限度地发挥益处、同时最大限度地减少副作用（尤其是免疫反应）的表达水平。Gluc-RMA 在不同 AAV 剂量的 hSyn 启动子下在左侧尾壳中表达。结果显示，所有剂量的血浆 RMA 信号均显着，而没有显着的神经元损失，这表明 Gluc-RMA 的任何潜在副作用即使在最高剂量下也不足以导致神经元死亡。

研究人员还监测了脑细胞类型特异性基因的表达。他们将 hSyn 控制的双 flox-RMA 注入酪氨酸羟化酶-Cre (Th-Cre) 小鼠体内，该小鼠在多巴胺能神经元中表达 Cre。该研究在局部注射部位的 Th 阳性细胞中发现了 Gluc-RMA 和 GFP 的特异性表达，证明了 Gluc-RMA 能够以细胞类型特异性的方式检测小神经元细胞群中的大脑基因表达。

此外，还研究了 RMA 追踪立即早期基因 Fos 表达变化的能力，该基因在细胞刺激或神经元活动时快速表达。使用使用受 Fos 启动子控制的 Gluc-RMA 转染的 PC-12 细胞的体外模型。

结果显示，神经生长因子诱导后 Gluc-RMA 和 Fos 的表达增加，培养基的发光信号在暴露后六小时内显着上升，表明 Gluc-RMA 可以响应启动子的变化而产生可区分的信号输出活动。

最后，该研究探索了用于非侵入性测量神经元活动的 RMA。采用双条件策略，将 Gluc-RMA 表达与神经元活动联系起来。该研究证明了 RMA 的多重比率测量及其报告特定大脑区域体内神经元活动的能力。此外，Gluc-RMA 用于改善生物发光成像 (BLI)，显示信号强度增强以及与基因表达水平的相关性。