背景

原发性 GBM 是一种侵袭性肿瘤，治疗具有挑战性。尽管采用多模式治疗方案，中位生存期仍为 12 至 15 个月。研究表明肿瘤内存在广泛的异质性，细胞亚群表现出不同的基因表达模式、突变、表观遗传状态和拷贝数畸变，这也使得针对特定分子过程的治疗无效。

替莫唑胺 (TMZ) 是目前 GBM 的一线化疗药物，对 TMZ 的敏感性由 O-6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶 (MGMT) 启动子的甲基化决定。尽管基于 TMZ 的治疗可以提高生存率并且副作用较少，但大多数患者都会经历疾病进展。

TMZ 还会增加体细胞突变率，再加上 DNA 错配修复 (MMR) 途径的丧失和肿瘤基因组的不稳定性，从而导致超突变。目前，对于高突变神经胶质瘤没有有效的治疗方法。因此，迫切需要消除 GBM 细胞的疗法，无论其突变情况如何。

研究和结果

在本研究中，研究人员引入了基因组/癌症脱落，这是一种基于 CRISPR 的治疗策略，通过针对肿瘤基因组中的独特重复序列来治疗原发性/复发性 GBM。首先，他们将患者的原发性和复发性 GBM 与其天然基因组进行了比较。患者接受手术切除、辅助放疗和TMZ化疗，11个月后复发。

肿瘤突变负荷的量化显示，原发性 GBM 和复发性 GBM 的中位数分别为每兆碱基 123 个和 217 个突变，将两者归类为超突变。原发性 GBM 和复发性 GBM 中的非编码基因组分别有超过 4,400 个和 11,600 个蛋白质编码突变，以及 451,484 个和 698,557 个突变。

研究人员计算了患者天然基因组以及原发性和复发性 GBM 中可能存在的化脓性链球菌CRISPR 相关 9 (Cas9) 单引导 RNA (sgRNA)。这个目标空间中可能存在数亿个 sgRNA，称为“sgRNA-ome”，其中很大一部分具有多个目标位点。研究小组将这些具有重复靶位点的 sgRNA 称为 sgCIDE（CRISPR-编辑诱导死亡）。

接下来，他们选择了前 10 个 sgCIDE，具有 3000 至 300,000 个靶位点，以评估 CRISPR-Cas9 通过靶向重复序列消除 GBM 的能力。Cas9 和 10 sgCIDE 在 LN-229 和 U-251 GBM 细胞中的稳定表达导致细胞剧烈而快速地耗竭，而表达非靶向 sgRNA 的细胞则不会耗竭。

表达 Cas9 的细胞在用 sgCIDE 转导 24 小时后显示出广泛的基因组断裂。此外，实时定量活细胞成像表明，sgCIDE 在转导后第一天引起生长抑制，并在第二天引起细胞死亡。接下来，研究小组在 TMZ 敏感和耐药 GBM 中测试了基因组粉碎。

表达 Cas9 的 TMZ 耐药性 LN-18 和 T98G 以及 TMZ 敏感的 LN-229 和 U-251 GBM 细胞用 TMZ 处理或用含有 sgCIDE 的慢病毒载体转导。细胞活力定量揭示了 TMZ 剂量滴定的预期效果，仅在 TMZ 敏感细胞中具有明显的致死作用。相比之下，sgCIDE 的表达在所有四种细胞系中引起病毒滴度依赖性致死，与MGMT启动子的甲基化状态无关。

集落形成测定显示，相对于二甲亚砜 (DMSO) 处理的细胞，经 TMZ 处理的 U-251 细胞中集落减少了 1 至 2 个对数级，而观察到集落减少了 2 至 3 个对数级与 sgCIDE 转导。然而，一些 sgCIDE 转导的细胞存活并形成集落。

建立了这些逃逸克隆的单克隆细胞系，并开发了表达 sgRNA 和 mCherry 的慢病毒载体或编码 sgRNA 和 mCherry 标记的 Cas9 的一体化版本。用仅提供新 sgRNA 的载体重新处理逃逸克隆未能导致细胞耗竭，而用一体化载体重新处理则导致有效的细胞消融。

其他研究表明，对于完全互补的靶位点，有效消除细胞所需的 DSB 的最小数量为 30 个，对于具有单个错配的靶位点，所需的 DSB 的最小数量为 70 个。由于基因组粉碎的目标也存在于正常基因组中，研究人员推测，超突变神经胶质瘤中的癌症特异性突变可能具有独特的序列，可用于癌症特异性基因组粉碎（癌症粉碎）。

复发性 GBM 显示出超突变 GBM 特有的 TMZ 突变特征（胞嘧啶至胸腺嘧啶的转化升高）。接下来，研究小组使用复发性 GBM 衍生细胞系来评估 TMZ 突变特征是否可用于特定靶向和细胞消融。这种源自患者的细胞系 (PDCL) 名为 SF11411，与其他 GBM 细胞系一样，对基因组粉碎具有相似的敏感性。

研究人员发现了 10 种重复且独特的 sgRNA，这些 sgRNA 是复发性肿瘤所特有的。为了验证，该团队在正常人星形胶质细胞 (NHA) 和 PDCL SF11411 中进行了大规模 CRISPR 筛选。CRISPR 库包含（约 5000 个）针对单个基因座或多个基因座的非编码和编码基因组的指南、sgCIDE、非靶向对照和安全港参考。

使用下一代测序来比较 NHA，并在转导后第 1 天和 28 天用 CRISPR 文库以单拷贝转导 PDCL 细胞。正如预期的那样，两种细胞系中的大多数 sgCIDE 均被耗尽。非靶向对照在两种细胞系中均具有中性作用，而癌症特异性重复 sgRNA 仅在 SF11411 中被耗尽，但在 NHA 中富集。

结论

总而言之，该研究描述了 CRISPR 介导的基因组/癌症粉碎来治疗复发性神经胶质瘤。癌症粉碎依赖于针对重复的肿瘤特异性位点，触发 CRISPR 介导的基因组碎片和 DNA 损伤诱导的细胞死亡。此外，基因组粉碎与 TMZ 敏感性和 GBM 细胞的表观遗传状态无关。

大多数细胞都会因最初的 DNA 损伤而死亡，少数逃脱的细胞可以得到有效的重新治疗。肿瘤特异性重复序列的存在可以通过针对治疗诱导的突变特征来粉碎癌症。总体而言，这些发现为开发癌症特异性疗法来治疗高突变神经胶质瘤和其他高突变癌症提供了潜在途径。