严重联合免疫缺陷(SCID)代表罕见的单基因疾病,伴有体液和细胞免疫缺陷。RAG基因编码启动淋巴特异性 V(D)J 重组的蛋白质,这对 T 细胞和 B 细胞的成熟至关重要。因此,具有致病RAG变异的个体完全缺乏或具有显着较少的 B 和T 细胞。
此外,RAG基因转录受其各自编码序列 (CDS) 周围的顺式作用序列调节。RAG基因仅在 G0/G1 阶段表达,并在 B 和 T 细胞发育的特定阶段调节表达。异基因造血干细胞移植(HSCT)是 SCID 的唯一确定性治疗方法。
然而,人类白细胞抗原(HLA) 匹配的供体很少见,而替代疗法半相合 HSCT 将存活率降低至 60% 至 70%。理想的替代方案是对患者的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 进行离体操作,然后以自体 HSCT 的形式转移至患者体内。
在本研究中,研究人员描述了一种基于成簇规则散布的短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关核酸酶 9 (Cas9) 的基因组编辑方法,用分化 34 阳性簇中的校正转基因替换整个 RAG2 CDS(CD34+) HSPC。
合成了两个重组腺相关病毒血清型 6 (rAAV6) 载体,在传递修饰的RAG2单引导 RNA (sgRNA )后,将绿色荧光蛋白 (GFP) 表达盒和牛生长激素 PolyA (BGHpA) 序列整合到 CD34 + HSPC中) 或 Cas9 核糖核蛋白复合物。
第一个供体使用 Cas9 切割位点两侧的 400 bp 同源臂进行插入。相比之下,第二个供体使用覆盖切割位点上游序列的 400 bp 左同源臂 (LHA) 和跨越RAG2终止密码子下游序列的 400 bp 右同源臂 (RHA),将整个 RAG2CDS替换为供体 DNA(以下称为 CDS 替换 [CDSR] 载体)。
第一个供体的同源定向修复(HDR)效率高于第二个供体。当RHA长度增加到800 bp或1600 bp时,第二供体的HDR效率显着增加。接下来,该团队制作了两个额外的 CDSR 载体;一种具有 BGHpA 和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件 (WPRE) 序列,而另一种则两者均缺失。
缺乏这两个元件的载体诱导较低的 HDR,而另一个元件的 HDR 效率与扩展的第二供体的 HDR 效率相当。此外,该团队还设计了具有 400 x 800 bp 同源臂模式的 CDSR 校正供体,用于分歧密码子优化RAG2(dcoRAG2) 编码 DNA (cDNA)的敲入 (KI) 。dcoRAG2终止密码子被 T2A 自切割肽序列和截短的神经生长因子受体 (tNGFR) 报告基因取代。
此外,还合成了两个额外的 CDSR 校正供体,其具有遵循 tNGFR 序列的合成调节元件。一个包含 WPRE-BGHpA 序列,另一个包含 BGHpA 序列。校正供体显示出有效的位点特异性 HDR。In-out聚合酶链式反应(PCR)结果证实了HDR的高效性。
该团队进行了反向末端重复(ITR)测序来检测rAAV6供体ITR的整合,因为AAV供体载体可以随机整合到基因组中。这表明 ITR 的整合有限,尽管不在目标地点。接下来,该团队在健康供体 (HD) 衍生的 CD34 +HSPC中设计了基因型。
研究小组获得的细胞中,一个等位基因由其中一位校正供体靶向,而另一种等位基因则带有敲除(KO)模板。开发了一种两步法来富集约 100% 编辑等位基因的细胞。接下来,研究小组测试了 dcoRAG2表达是否特异性地允许分化为具有不同 T 细胞受体 (TCR) 库的CD3+ T 细胞。
事实上,内源性RAG2表达在 KI-KO 细胞中被消除,但 dcoRAG2cDNA 表达强劲。此外,dcoRAG2转基因表达仍然受到严格调节并且没有过度表达,从而通过工程化细胞在第28天分化为CD3+ T细胞来促进T细胞的发育。
CD3+群体也显示出强劲的 TCRγδ 表达,并且 CD3+TCRγδ-细胞被推测为 CD3+TCRαβ+。第28天dco RAG2 cDNA表达后,在RAG2KI-KO细胞中观察到多样化的V(D)J重组库,模拟和KI-KO群体之间的TCRγ (TRG)或TCRβ (TRB)克隆型没有任何显着差异。
研究人员描述了一种完全替代RAG2CDS 来治疗常染色体隐性免疫疾病的策略。CDSR方法诱导dcoRAG2cDNA表达而不超过内源RAG2表达水平。CDSR 校正供体促进了 V(D)J 成功重组并分化为 CD3+TCRγδ+和 CD3+TCRαβ+T 细胞,这些细胞发育成不同的 TRG 和 TRB 库。
总体而言,这种方法可以在维持内源性时空和调控元件的同时治疗突变,并且有望成为更安全的基因治疗。